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熙寧小課-第146期 | 免疫組庫測序打開藥物研發(fā)新視野(五):TCR免疫組庫測序在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用(上)
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時間:2024-06-19

免疫組庫測序打開藥物研發(fā)新視野(一):什么是免疫組庫測序?、免疫組庫測序打開藥物研發(fā)新視野(二):免疫組庫檢測的方法有哪些?兩篇文章介紹了免疫組庫的基本概念、人體內(nèi)免疫組庫多樣性產(chǎn)生的生物學(xué)過程及免疫組庫常用檢測方法。本文將重點介紹免疫組庫測序在TCR相關(guān)的腫瘤免疫治療中的應(yīng)用,并對檢測結(jié)果進行生物學(xué)意義解讀。


PART 01

TCR在腫瘤免疫治療中發(fā)揮核心作用


TCR(T細(xì)胞受體)是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵受體,它們在腫瘤治療中發(fā)揮核心作用。TCR主要存在于T細(xì)胞表面,負(fù)責(zé)識別并結(jié)合由抗原呈遞細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)通過MHC分子(主要組織相容性復(fù)合體)呈遞的多肽片段。當(dāng)TCR與抗原-MHC復(fù)合物結(jié)合后,會觸發(fā)T細(xì)胞活化和增殖,從而分化為不同的效應(yīng)子T細(xì)胞亞群,包括CD8+ 細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4+ 輔助T細(xì)胞。

CD8+ 細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)能夠特異性識別并消滅表達(dá)異??乖哪[瘤細(xì)胞。它們通過與腫瘤細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類分子結(jié)合而被激活,該復(fù)合體呈遞的是來源于腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的多肽片段。當(dāng)CD8+ T細(xì)胞識別到這些抗原后,它們會釋放穿孔素、顆粒酶和其他效應(yīng)因子,導(dǎo)致靶向的腫瘤細(xì)胞裂解死亡。

CD4+ 輔助T細(xì)胞(Th cells)能夠識別抗原呈遞細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞)上MHCⅡ類分子結(jié)合的肽段,并通過與這些細(xì)胞相互作用而被激活。激活后的CD4+ T細(xì)胞可以分化為不同的輔助亞型,包括Th1、Th2、Th17等,分別分泌不同類型的細(xì)胞因子來激活和調(diào)控其他免疫細(xì)胞。并且通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能,包括促進B細(xì)胞產(chǎn)生抗體(參與體液免疫),以及激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等進行細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),這對于疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。

腫瘤免疫治療通過增強患者的免疫系統(tǒng)識別和攻擊腫瘤細(xì)胞的能力,或克服腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機制,從而達(dá)到控制、縮小甚至消除腫瘤的目的,包括但不限于免疫檢查點抑制劑、CAR-T細(xì)胞療法、腫瘤疫苗以及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)療法等。腫瘤免疫治療通過多種機制直接影響免疫系統(tǒng)中各類免疫細(xì)胞的數(shù)量、種類和功能狀態(tài),TCR免疫組庫測序可以檢測腫瘤特異性的T細(xì)胞克隆、評估腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)、評估免疫治療效果、監(jiān)測治療前后的免疫應(yīng)答變化,并且可以輔助預(yù)測治療反應(yīng)與患者預(yù)后。


PART 02

單個樣本TCR免疫組庫測序結(jié)果


熙寧|精翰NGS實驗室開發(fā)了成熟的免疫組庫測序生信分析流程,對檢測樣本進行 T 細(xì)胞受體基因克隆鑒定檢測,并對受檢者的不同時間節(jié)點的樣本進行 T 細(xì)胞受體基因克隆鑒定檢測,對特定的TCR 的克隆比例,克隆多樣性、V/J 基因的使用頻率進行統(tǒng)計,識別樣本間的共有克隆,并追蹤不同樣本 TCR 指標(biāo)的動態(tài)變化,如克隆總數(shù)、克隆類型、多樣性指數(shù)、克隆豐度等,輔助評估免疫治療的臨床效果。

本文將以TRB為例,從克隆多樣性、CDR3長度分布、V-J基因使用頻率分布等方面對單個樣本的TCR免疫組庫測序結(jié)果進行展示,并從生物學(xué)角度對檢測結(jié)果進行解讀(注:圖示中所有數(shù)據(jù)均來自虛擬樣本)。



2.1 克隆多樣性


計算樣本TCR組成多樣性的指標(biāo)有Shannon’s entropy,Inverse Simpson’s index,Evenness,Clonality。

?  Shannon’s entropy 計算公式:


?  Inverse Simpson’s index 計算公式:


?  Evenness 計算公式:


?  Clonality 計算公式:


其中:s 表示實際觀測到的 TCR 重組序列的數(shù)目;Pi表示第 i 個 TCR 重排序列在所有 TCR 中所占的比例。

Shannon 和 Inverse Simpson 值越大,說明樣本的 TCR 多樣性越高。Evenness 的取值范圍為 0~1,指樣本的均勻度。 Clonality 的取值范圍為 0~1,指樣本的克隆性。

TCR克隆多樣性與年齡呈顯著正相關(guān),隨著年齡的增加TCR的多樣性呈現(xiàn)下降趨勢。TCR多樣性的異常增高,與免疫系統(tǒng)訓(xùn)練不充分有關(guān);TCR多樣性的異常減少與免疫缺陷、免疫系統(tǒng)發(fā)育不全以及腫瘤性或反應(yīng)性T細(xì)胞大量擴增有關(guān)。



2.2  CDR3 長度分布


在某些疾病狀態(tài)下,例如自身免疫性疾病、某些感染疾?。ㄈ鏗IV感染)以及癌癥,可能會觀察到TCR CDR3長度譜的改變。比如,在某些腫瘤患者中,可能會發(fā)現(xiàn)TCR CDR3的長度分布出現(xiàn)偏移,這可能是由于腫瘤特異性T細(xì)胞克隆擴增或者免疫反應(yīng)失衡所導(dǎo)致。此外,某些病毒感染后,為了應(yīng)對病毒抗原變異,T細(xì)胞庫可能會產(chǎn)生更多具有特定CDR3長度的克隆。

統(tǒng)計樣本內(nèi)CDR3區(qū)域的核苷酸序列的長度分布與頻率的關(guān)系,柱狀圖分別由頻率最高的20種CDR3氨基酸序列與V片段填充,結(jié)果分別見圖1與圖2:

圖1 CDR3 核苷酸序列長度與Top20 序列分布直方圖


上圖中橫坐標(biāo)表示CDR3核苷酸序列的長度,縱坐標(biāo)表示對應(yīng)長度CDR3數(shù)量在所有CDR3的比例,展示頻率最高的20種CDR3的多肽序列。

圖2 CDR3 核苷酸序列長度與Top V片段分布直方圖


上圖中橫坐標(biāo)表示CDR3核苷酸序列的長度,縱坐標(biāo)表示對應(yīng)長度CDR3數(shù)量在所有CDR3的比例,展示頻率最高的 20 種 V 片段的分布。



2.3  V/J片段使用頻率統(tǒng)計


截止到2024年2月26日,根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計,人類基因組總共包含 237-243 個 TR 基因,具體基因數(shù)取決于單倍體類型。每個單倍體基因組的功能性 TR 基因數(shù)量為 172-185。TR基因在染色體上的分布及各片段的數(shù)目統(tǒng)計如下表:

統(tǒng)計樣本內(nèi)V片段與J片段的使用頻率,結(jié)果分別見圖3與圖4,并統(tǒng)計V-J對的組合與使用頻率,結(jié)果見圖5與圖6:

圖3 V 基因使用頻率分布直方圖


上圖中橫坐標(biāo)表示不同的V片段的名稱,縱坐標(biāo)表示對應(yīng)V片段的使用頻率。

圖4 J 基因使用頻率分布直方圖


上圖中橫坐標(biāo)表示不同的 J 片段的名稱,縱坐標(biāo)表示對應(yīng) J 片段的使用頻率

圖5 V-J 基因?qū)κ褂妙l率分布環(huán)形圖


上圖為 V-J 對使用頻率分布環(huán)形圖。弧對應(yīng)于不同的 V 片段和 J 片段,按其在樣本中的頻率進行縮放。絲帶代表 V-J 配對,其大小按配對頻率縮放

圖6 V-J 基因?qū)κ褂妙l率分布三維柱狀圖


上圖為 V-J 對三維柱狀圖。其中 X 軸表示 V 片段的名稱,Y 軸表示 J 片段的名稱,Z 軸表示克隆頻率。

在疾病進程中,TCR V和J基因的使用頻率偏好性可能出現(xiàn)顯著變化。這是因為疾病狀態(tài)下,某些特定的T細(xì)胞克隆可能因為針對某種抗原的高親和力而被強烈激活和擴增,從而導(dǎo)致某些V或J基因的使用頻率增加。例如,在某些類型的腫瘤中,已發(fā)現(xiàn)存在腫瘤特異性T細(xì)胞克隆的富集,表現(xiàn)為TCR V和J基因使用頻率的非隨機性分布。另一方面,在某些疾病相關(guān)的抗原刺激下,某些特定的TCR克隆占主導(dǎo)地位時,可能導(dǎo)致TCR多樣性下降,使得原本廣泛分布的V或J基因使用頻率變得集中。

隨著年齡的增長,免疫系統(tǒng)經(jīng)歷正常的生理衰老過程,稱為免疫衰老。在這個過程中,T細(xì)胞庫的多樣性可能會減少,一部分高頻使用的V或J基因組合可能會更頻繁地出現(xiàn),同時罕見的組合可能減少,導(dǎo)致整體TCR多樣性降低。

此外,老年個體可能對新抗原的免疫響應(yīng)減弱,這也可能影響TCR V和J基因的使用頻率偏好性,使其傾向于維持以前接觸過的抗原的記憶反應(yīng),而不是產(chǎn)生新的克隆來應(yīng)對新挑戰(zhàn)。

TCR V和J基因的頻率偏好性與疾病進程或年齡的相關(guān)性是復(fù)雜的,依賴于多種因素,包括個體的遺傳背景、環(huán)境暴露、疾病類型和嚴(yán)重程度等。


PART 03

小結(jié)


在腫瘤過繼性免疫治療中,如CAR-T細(xì)胞療法和TILs免疫療法,對治療后的受檢者的不同時間節(jié)點的樣本進行TCR免疫組庫測序,統(tǒng)計注射液的TCR克隆殘留比例,識別樣本間的共有克隆,并追蹤不同樣本TCR指標(biāo)的動態(tài)變化,可以輔助評估藥物的治療效果。下期文章即將介紹在腫瘤免疫治療中對時序樣本的檢測,敬請期待。

熙寧|精翰NGS實驗室應(yīng)用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因(TRB、TRD、TRG,以及IgH、IgL、IgK),檢測T/B細(xì)胞受體基因的克隆性重排,通過專業(yè)的生物信息學(xué)流程分析識別受體可變區(qū),統(tǒng)計樣本的克隆多樣性及V/J片段的使用頻率,從而揭示個體的免疫表達(dá)譜。本檢測方法已經(jīng)經(jīng)過了完善的性能驗證,可以供申辦方直接使用。

熙寧|精翰NGS實驗室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求,建立了完善的質(zhì)量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀,支持本地測序,且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質(zhì)量體系的要求,實驗室建立了豐富的檢測方法,全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標(biāo)志物的探索等,在藥物研發(fā)的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用:


?  

以慢病毒為載體的CAR-T細(xì)胞治療中,識別有致瘤性的或者其他潛在危險的整合位點,評估整合事件的多樣性和偏好性,輔助評估藥物潛在的安全性風(fēng)險;

?  

通過對腫瘤微小殘留病灶(MRD)的檢測,評估藥物治療效果并提示預(yù)后,提前提示復(fù)發(fā)風(fēng)險并指導(dǎo)后續(xù)干預(yù);

?  

通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序,幫助申辦方識別與疾病關(guān)聯(lián)的基因突變、融合突變和拷貝數(shù)變異等,識別受試者藥物靶點變異情況,以及與藥物轉(zhuǎn)運、代謝和相關(guān)信號通路的基因變化,從而指導(dǎo)患者入排,發(fā)現(xiàn)藥物研發(fā)的潛在靶點和生物標(biāo)志物,并指導(dǎo)耐藥機制研究和新的治療策略開發(fā);

?  

評估候選藥物對基因表達(dá)的影響,篩選出對特定靶標(biāo)有顯著作用的化合物,同時通過分析藥物處理前后基因表達(dá)變化,優(yōu)化藥物的劑量、作用機制和潛在副作用。



歡迎后臺留言咨詢。



參考文獻(xiàn)(上下滑動翻看)

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