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免疫組庫測序打開藥物研發(fā)新視野（一）：什么是免疫組庫測序？、免疫組庫測序打開藥物研發(fā)新視野（二）：免疫組庫檢測的方法有哪些？兩篇文章介紹了免疫組庫的基本概念、人體內(nèi)免疫組庫多樣性產(chǎn)生的生物學(xué)過程及免疫組庫常用檢測方法。本文將重點(diǎn)介紹免疫組庫測序在TCR相關(guān)的腫瘤免疫治療中的應(yīng)用，并對檢測結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)意義解讀。
PART 01
TCR在腫瘤免疫治療中發(fā)揮核心作用
TCR（T細(xì)胞受體）是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵受體，它們在腫瘤治療中發(fā)揮核心作用。TCR主要存在于T細(xì)胞表面，負(fù)責(zé)識別并結(jié)合由抗原呈遞細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等）通過MHC分子（主要組織相容性復(fù)合體）呈遞的多肽片段。當(dāng)TCR與抗原-MHC復(fù)合物結(jié)合后，會(huì)觸發(fā)T細(xì)胞活化和增殖，從而分化為不同的效應(yīng)子T細(xì)胞亞群，包括CD8+ 細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4+ 輔助T細(xì)胞。
CD8+ 細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTLs）能夠特異性識別并消滅表達(dá)異?？乖哪[瘤細(xì)胞。它們通過與腫瘤細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子結(jié)合而被激活，該復(fù)合體呈遞的是來源于腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的多肽片段。當(dāng)CD8+ T細(xì)胞識別到這些抗原后，它們會(huì)釋放穿孔素、顆粒酶和其他效應(yīng)因子，導(dǎo)致靶向的腫瘤細(xì)胞裂解死亡。
CD4+ 輔助T細(xì)胞（Th cells）能夠識別抗原呈遞細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞）上MHCⅡ類分子結(jié)合的肽段，并通過與這些細(xì)胞相互作用而被激活。激活后的CD4+ T細(xì)胞可以分化為不同的輔助亞型，包括Th1、Th2、Th17等，分別分泌不同類型的細(xì)胞因子來激活和調(diào)控其他免疫細(xì)胞。并且通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，包括促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體（參與體液免疫），以及激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這對于疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。
腫瘤免疫治療通過增強(qiáng)患者的免疫系統(tǒng)識別和攻擊腫瘤細(xì)胞的能力，或克服腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制，從而達(dá)到控制、縮小甚至消除腫瘤的目的，包括但不限于免疫檢查點(diǎn)抑制劑、CAR-T細(xì)胞療法、腫瘤疫苗以及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）療法等。腫瘤免疫治療通過多種機(jī)制直接影響免疫系統(tǒng)中各類免疫細(xì)胞的數(shù)量、種類和功能狀態(tài)，TCR免疫組庫測序可以檢測腫瘤特異性的T細(xì)胞克隆、評估腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)、評估免疫治療效果、監(jiān)測治療前后的免疫應(yīng)答變化，并且可以輔助預(yù)測治療反應(yīng)與患者預(yù)后。
PART 02
單個(gè)樣本TCR免疫組庫測序結(jié)果
熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了成熟的免疫組庫測序生信分析流程，對檢測樣本進(jìn)行 T 細(xì)胞受體基因克隆鑒定檢測，并對受檢者的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的樣本進(jìn)行 T 細(xì)胞受體基因克隆鑒定檢測，對特定的TCR 的克隆比例，克隆多樣性、V/J 基因的使用頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，識別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本 TCR 指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，如克隆總數(shù)、克隆類型、多樣性指數(shù)、克隆豐度等，輔助評估免疫治療的臨床效果。
本文將以TRB為例，從克隆多樣性、CDR3長度分布、V-J基因使用頻率分布等方面對單個(gè)樣本的TCR免疫組庫測序結(jié)果進(jìn)行展示，并從生物學(xué)角度對檢測結(jié)果進(jìn)行解讀（注：圖示中所有數(shù)據(jù)均來自虛擬樣本）。
2.1 克隆多樣性
計(jì)算樣本TCR組成多樣性的指標(biāo)有Shannon’s entropy，Inverse Simpson’s index，Evenness，Clonality。
? Shannon’s entropy 計(jì)算公式：
? Inverse Simpson’s index 計(jì)算公式：
? Evenness 計(jì)算公式：
? Clonality 計(jì)算公式：
其中：s 表示實(shí)際觀測到的 TCR 重組序列的數(shù)目；Pi表示第 i 個(gè) TCR 重排序列在所有 TCR 中所占的比例。
Shannon 和 Inverse Simpson 值越大，說明樣本的 TCR 多樣性越高。Evenness 的取值范圍為 0~1，指樣本的均勻度。 Clonality 的取值范圍為 0~1，指樣本的克隆性。
TCR克隆多樣性與年齡呈顯著正相關(guān)，隨著年齡的增加TCR的多樣性呈現(xiàn)下降趨勢。TCR多樣性的異常增高，與免疫系統(tǒng)訓(xùn)練不充分有關(guān)；TCR多樣性的異常減少與免疫缺陷、免疫系統(tǒng)發(fā)育不全以及腫瘤性或反應(yīng)性T細(xì)胞大量擴(kuò)增有關(guān)。
2.2 CDR3 長度分布
在某些疾病狀態(tài)下，例如自身免疫性疾病、某些感染疾?。ㄈ鏗IV感染）以及癌癥，可能會(huì)觀察到TCR CDR3長度譜的改變。比如，在某些腫瘤患者中，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)TCR CDR3的長度分布出現(xiàn)偏移，這可能是由于腫瘤特異性T細(xì)胞克隆擴(kuò)增或者免疫反應(yīng)失衡所導(dǎo)致。此外，某些病毒感染后，為了應(yīng)對病毒抗原變異，T細(xì)胞庫可能會(huì)產(chǎn)生更多具有特定CDR3長度的克隆。
統(tǒng)計(jì)樣本內(nèi)CDR3區(qū)域的核苷酸序列的長度分布與頻率的關(guān)系，柱狀圖分別由頻率最高的20種CDR3氨基酸序列與V片段填充，結(jié)果分別見圖1與圖2：
圖1 CDR3 核苷酸序列長度與Top20 序列分布直方圖
上圖中橫坐標(biāo)表示CDR3核苷酸序列的長度，縱坐標(biāo)表示對應(yīng)長度CDR3數(shù)量在所有CDR3的比例，展示頻率最高的20種CDR3的多肽序列。
圖2 CDR3 核苷酸序列長度與Top V片段分布直方圖
上圖中橫坐標(biāo)表示CDR3核苷酸序列的長度，縱坐標(biāo)表示對應(yīng)長度CDR3數(shù)量在所有CDR3的比例，展示頻率最高的 20 種 V 片段的分布。
2.3 V/J片段使用頻率統(tǒng)計(jì)
截止到2024年2月26日，根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計(jì)，人類基因組總共包含 237-243 個(gè) TR 基因，具體基因數(shù)取決于單倍體類型。每個(gè)單倍體基因組的功能性 TR 基因數(shù)量為 172-185。TR基因在染色體上的分布及各片段的數(shù)目統(tǒng)計(jì)如下表：
統(tǒng)計(jì)樣本內(nèi)V片段與J片段的使用頻率，結(jié)果分別見圖3與圖4，并統(tǒng)計(jì)V-J對的組合與使用頻率，結(jié)果見圖5與圖6：
圖3 V 基因使用頻率分布直方圖
上圖中橫坐標(biāo)表示不同的V片段的名稱，縱坐標(biāo)表示對應(yīng)V片段的使用頻率。
圖4 J 基因使用頻率分布直方圖
上圖中橫坐標(biāo)表示不同的 J 片段的名稱，縱坐標(biāo)表示對應(yīng) J 片段的使用頻率
圖5 V-J 基因?qū)κ褂妙l率分布環(huán)形圖
上圖為 V-J 對使用頻率分布環(huán)形圖?；?yīng)于不同的 V 片段和 J 片段，按其在樣本中的頻率進(jìn)行縮放。絲帶代表 V-J 配對，其大小按配對頻率縮放
圖6 V-J 基因?qū)κ褂妙l率分布三維柱狀圖
上圖為 V-J 對三維柱狀圖。其中 X 軸表示 V 片段的名稱，Y 軸表示 J 片段的名稱，Z 軸表示克隆頻率。
在疾病進(jìn)程中，TCR V和J基因的使用頻率偏好性可能出現(xiàn)顯著變化。這是因?yàn)榧膊顟B(tài)下，某些特定的T細(xì)胞克隆可能因?yàn)獒槍δ撤N抗原的高親和力而被強(qiáng)烈激活和擴(kuò)增，從而導(dǎo)致某些V或J基因的使用頻率增加。例如，在某些類型的腫瘤中，已發(fā)現(xiàn)存在腫瘤特異性T細(xì)胞克隆的富集，表現(xiàn)為TCR V和J基因使用頻率的非隨機(jī)性分布。另一方面，在某些疾病相關(guān)的抗原刺激下，某些特定的TCR克隆占主導(dǎo)地位時(shí)，可能導(dǎo)致TCR多樣性下降，使得原本廣泛分布的V或J基因使用頻率變得集中。
隨著年齡的增長，免疫系統(tǒng)經(jīng)歷正常的生理衰老過程，稱為免疫衰老。在這個(gè)過程中，T細(xì)胞庫的多樣性可能會(huì)減少，一部分高頻使用的V或J基因組合可能會(huì)更頻繁地出現(xiàn)，同時(shí)罕見的組合可能減少，導(dǎo)致整體TCR多樣性降低。
此外，老年個(gè)體可能對新抗原的免疫響應(yīng)減弱，這也可能影響TCR V和J基因的使用頻率偏好性，使其傾向于維持以前接觸過的抗原的記憶反應(yīng)，而不是產(chǎn)生新的克隆來應(yīng)對新挑戰(zhàn)。
TCR V和J基因的頻率偏好性與疾病進(jìn)程或年齡的相關(guān)性是復(fù)雜的，依賴于多種因素，包括個(gè)體的遺傳背景、環(huán)境暴露、疾病類型和嚴(yán)重程度等。
PART 03
小結(jié)
在腫瘤過繼性免疫治療中，如CAR-T細(xì)胞療法和TILs免疫療法，對治療后的受檢者的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的樣本進(jìn)行TCR免疫組庫測序，統(tǒng)計(jì)注射液的TCR克隆殘留比例，識別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本TCR指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，可以輔助評估藥物的治療效果。下期文章即將介紹在腫瘤免疫治療中對時(shí)序樣本的檢測，敬請期待。
熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地?cái)U(kuò)增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細(xì)胞受體基因的克隆性重排，通過專業(yè)的生物信息學(xué)流程分析識別受體可變區(qū)，統(tǒng)計(jì)樣本的克隆多樣性及V/J片段的使用頻率，從而揭示個(gè)體的免疫表達(dá)譜。本檢測方法已經(jīng)經(jīng)過了完善的性能驗(yàn)證，可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求，建立了完善的質(zhì)量體系。實(shí)驗(yàn)室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗(yàn)證。按照質(zhì)量體系的要求，實(shí)驗(yàn)室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標(biāo)志物的探索等，在藥物研發(fā)的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用：
?
以慢病毒為載體的CAR-T細(xì)胞治療中，識別有致瘤性的或者其他潛在危險(xiǎn)的整合位點(diǎn)，評估整合事件的多樣性和偏好性，輔助評估藥物潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)；
?
通過對腫瘤微小殘留病灶（MRD）的檢測，評估藥物治療效果并提示預(yù)后，提前提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)并指導(dǎo)后續(xù)干預(yù)；
?
通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，幫助申辦方識別與疾病關(guān)聯(lián)的基因突變、融合突變和拷貝數(shù)變異等，識別受試者藥物靶點(diǎn)變異情況，以及與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和相關(guān)信號通路的基因變化，從而指導(dǎo)患者入排，發(fā)現(xiàn)藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，并指導(dǎo)耐藥機(jī)制研究和新的治療策略開發(fā)；
?
評估候選藥物對基因表達(dá)的影響，篩選出對特定靶標(biāo)有顯著作用的化合物，同時(shí)通過分析藥物處理前后基因表達(dá)變化，優(yōu)化藥物的劑量、作用機(jī)制和潛在副作用。
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