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熙寧小課-第164期 | 一文了解抗破傷風(fēng)毒素抗體的檢測(cè)方法
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時(shí)間:2024-12-20

破傷風(fēng)是一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,由破傷風(fēng)梭菌的孢子引起的急性感染性疾病。孢子在環(huán)境中無處不在,尤其是在土壤、塵灰、動(dòng)物和人類的腸道/糞便,以及表皮和生銹工具如釘子、針頭和鐵絲網(wǎng)上。由于極其耐熱和耐殺菌劑,孢子可以存活多年。在感染后,破傷風(fēng)的潛伏期自3天至21天不等。大多數(shù)病例發(fā)生在14天內(nèi)。

圖1 破傷風(fēng)梭菌示意圖


破傷風(fēng)患者自臨床恢復(fù)后不能因此獲得免疫,而破傷風(fēng)疫苗是預(yù)防破傷風(fēng)的有效途徑,自應(yīng)用以來明顯降低了破傷風(fēng)的發(fā)病率,對(duì)破傷風(fēng)疾病的預(yù)防起到了極其重要的作用。破傷風(fēng)疫苗免疫后產(chǎn)生的抗破傷風(fēng)毒素的抗體在抵御破傷風(fēng)方面發(fā)揮著重要作用。除疫苗制劑的主動(dòng)免疫外,破傷風(fēng)的被動(dòng)免疫也在臨床中用于破傷風(fēng)的短期應(yīng)急預(yù)防,其給藥后破傷風(fēng)毒素抗體效價(jià)水平變化是評(píng)價(jià)保護(hù)性的替代指標(biāo)。因而破傷風(fēng)毒素抗體效價(jià)水平的檢測(cè)具備重要的意義。

本文將介紹幾種常用的破傷風(fēng)抗體檢測(cè)方法:


PART 01

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(小鼠毒素中和試驗(yàn) )


體內(nèi)中和試驗(yàn)(In Vivo Neutralization Assay, IVN)是檢測(cè)抗破傷風(fēng)抗體的一種方法,被認(rèn)為是衡量血清中生物活性抗毒素抗體的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。

體內(nèi)中和試驗(yàn)通過在活體動(dòng)物(通常是小鼠)中評(píng)估血清樣本對(duì)破傷風(fēng)毒素的中和能力來檢測(cè)抗破傷風(fēng)抗體。這種方法能夠檢測(cè)到低至0.001國際單位每毫升(IU/mL)的中和抗體。

實(shí)驗(yàn)通常在小鼠中進(jìn)行,將一系列稀釋的測(cè)試血清與致死劑量的破傷風(fēng)毒素一起孵化,然后注射到小鼠體內(nèi)。通過與國際參考血清(如TE-3 WHO參考血清)標(biāo)準(zhǔn)化,可以得到以IU/mL為單位的結(jié)果。具體實(shí)驗(yàn)步驟見下圖:


圖2 體內(nèi)小鼠試驗(yàn)示意圖


小鼠體內(nèi)中和法測(cè)定破傷風(fēng)抗體效價(jià)存在一定的優(yōu)劣勢(shì)。

優(yōu)勢(shì)如下:

● 

特異性強(qiáng):小鼠體內(nèi)中和法被認(rèn)為是檢測(cè)特異抗體效價(jià)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,因?yàn)樗苷鎸?shí)地反映樣本的中和效價(jià)。

● 

靈敏度高:該方法能夠檢測(cè)到非常低水平的中和抗體,例如每毫升血清中0.001國際單位(IU/mL)的中和抗體。

● 

真實(shí)性:由于其基于生物學(xué)活性的測(cè)量,該方法能夠提供關(guān)于抗體中和能力的直接證據(jù)。

劣勢(shì)如下:

● 

成本高:小鼠體內(nèi)中和法需要使用大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,導(dǎo)致成本較高。

● 

勞動(dòng)密集:該方法操作復(fù)雜,需要大量的人力來進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作。

● 

時(shí)間消耗長(zhǎng):完成一次小鼠體內(nèi)中和試驗(yàn)需要較長(zhǎng)的時(shí)間,通常需要幾周。

● 

結(jié)果變異性:由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異,以及終點(diǎn)選擇的主觀性(如疾病癥狀或死亡),可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的變異性。

● 

缺乏國際標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議:目前沒有國際上標(biāo)準(zhǔn)化的協(xié)議,使得不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果難以直接比較。

● 

依賴于動(dòng)物:該方法依賴于活體動(dòng)物的使用,這在倫理和操作上都存在一定的限制。


PART 02

體外方法


破傷風(fēng)抗體與破傷風(fēng)毒素或類毒素之間的相互作用可以通過體外試驗(yàn)來測(cè)量,包括被動(dòng)血凝試驗(yàn)、放射免疫測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)或改良的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定( ELISAs)以及基于磁珠的免疫熒光測(cè)定。除了放射免疫測(cè)定外,這些技術(shù)都簡(jiǎn)單、靈敏、快速且成本低廉,但它們通常比體內(nèi)中和方法的特異性要低。因此,體外技術(shù)的結(jié)果應(yīng)該仔細(xì)解釋,并在可能的情況下與體內(nèi)中和方法進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 試驗(yàn)示意圖


被動(dòng)凝集試驗(yàn)

被動(dòng)血凝(Hemagglutination, HA)試驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單的體外測(cè)定方法,其中破傷風(fēng)毒素(Tetanus Toxin, TT)致敏的紅細(xì)胞在破傷風(fēng)抗體存在時(shí)會(huì)發(fā)生凝集。HA試驗(yàn)的可靠性受到限制,因?yàn)樗饕獪y(cè)量IgM,而IgM并不能中和破傷風(fēng)毒素。HA試驗(yàn)與中和試驗(yàn)之間的相關(guān)性是多變的。在含有高或中等滴度的血清中,HA試驗(yàn)與中和試驗(yàn)之間存在良好的相關(guān)性,但在低滴度時(shí),由于檢測(cè)到非功能性抗體,HA試驗(yàn)可能會(huì)高估結(jié)果。


放射免疫測(cè)定(RIA)試驗(yàn)

放射免疫測(cè)定(Radioimmunoassay, RIA)試驗(yàn)已被用來測(cè)定破傷風(fēng)抗體的效價(jià)。RIA試驗(yàn)有幾種可能的修改方式:破傷風(fēng)毒素(TT)可以與不溶性吸附劑(如纖維素或瓊脂糖)結(jié)合,或者像酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試驗(yàn)中那樣被動(dòng)吸附到塑料表面。特異性抗體與抗原免疫吸附劑結(jié)合,并通過測(cè)量與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合的同位素標(biāo)記的人類抗球蛋白的結(jié)合來定量。RIA試驗(yàn)的靈敏度高,結(jié)果與HA試驗(yàn)獲得的值有很好的相關(guān)性。然而,RIA試驗(yàn)所需的試劑和設(shè)備昂貴,且該技術(shù)只能由經(jīng)過高度培訓(xùn)的人員使用。


常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是檢測(cè)抗破傷風(fēng)IgG抗體最常用的測(cè)定方法。 如采用間接ELISA 法(測(cè)試血清中的抗體與固定相(微孔板孔表面)上的破傷風(fēng)毒素(TT)結(jié)合)。通常認(rèn)為抗體濃度高于0.16-0.2 IU/mL時(shí),間接ELISA與中和試驗(yàn)之間存在良好相關(guān)性。與中和試驗(yàn)相比,間接ELISA在低于這個(gè)范圍時(shí),可能高估了抗體水平。預(yù)測(cè)臨床保護(hù)的最低ELISA值為0.16 IU/mL。

ELISA對(duì)破傷風(fēng)抗毒素水平的高估和特異性不足可能歸因于幾個(gè)因素,例如抗體對(duì)抗原制劑中的污染物的非特異性結(jié)合,或者識(shí)別在抗原制劑中可能產(chǎn)生的非生物學(xué)重要表位。檢測(cè)到親和力較低的抗毒素,不足以在體內(nèi)中和毒素,也可能有助于抗體水平的高估。 另一種解釋可能是檢測(cè)到不對(duì)稱的、功能上單價(jià)的IgG抗體,這些抗體的毒素中和活性有限。

圖4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),間接ELISA法示意圖


改良的ELISA法

改良的ELISA法檢測(cè)破傷風(fēng)抗體是一種經(jīng)過優(yōu)化的檢測(cè)技術(shù),它提供了一種快速、準(zhǔn)確且具有良好特異性和重復(fù)性的破傷風(fēng)抗體檢測(cè)方法,對(duì)于評(píng)估破傷風(fēng)疫苗的免疫原性和破傷風(fēng)毒素抗體藥的有效性提供重要的信息。改良ELISA法有多種方法,如競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,雙抗原夾心ELISA,化學(xué)發(fā)光法,基于磁珠技術(shù)等??苫趯?shí)際需要,選擇合適的方法。


PART 03

小結(jié)


血清學(xué)指標(biāo)-抗毒素(類毒素)特異性IgG 被認(rèn)為與保護(hù)性最為相關(guān),開發(fā)和驗(yàn)證科學(xué)的方法對(duì)于破傷風(fēng)疫苗/破傷風(fēng)抗體藥有效性的評(píng)估非常重要。

熙寧生物|精翰生物以分析科學(xué)為核心能力,為新藥臨床與臨床前研究提供專業(yè)技術(shù)服務(wù)。我們?cè)谝呙缗R床研究領(lǐng)域具備完善的檢測(cè)平臺(tái),可為您提供一站式檢測(cè)分析服務(wù)。其中,在破傷風(fēng)研究領(lǐng)域,具有豐富的項(xiàng)目檢測(cè)經(jīng)驗(yàn),已支持多款破傷風(fēng)抗體藥的I/II/III期臨床試驗(yàn),檢測(cè)項(xiàng)涵蓋藥物藥代動(dòng)力學(xué)PK, 藥效學(xué)(抗破傷風(fēng)抗體效價(jià)水平),免疫原性評(píng)估(ADA和NAb),可高效助力申辦方的臨床研究,歡迎大家后臺(tái)留言咨詢交流。


參考文獻(xiàn):

[1] The immunological basis for immunization series: module3: tetanus (Immunological basis for immunization series; module 3). WHO. 2018

[2] 中國藥典通則3508 破傷風(fēng)抗毒素效價(jià)測(cè)定法(小鼠試驗(yàn)法)

[3] Wang Y, Wu C, Yu J, Lin S, Liu T, Zan L, Li N, Hong P, Wang X, Jia Z, Li J, Wang Y, Zhang M, Yuan X, Li C, Xu W, Zheng W, Wang X, Liao HX. Structural basis of tetanus toxin neutralization by native human monoclonal antibodies. Cell Rep. 2021 May 4;35(5):109070. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109070. PMID: 33951441.


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