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破傷風(fēng)是一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，由破傷風(fēng)梭菌的孢子引起的急性感染性疾病。孢子在環(huán)境中無處不在，尤其是在土壤、塵灰、動物和人類的腸道/糞便，以及表皮和生銹工具如釘子、針頭和鐵絲網(wǎng)上。由于極其耐熱和耐殺菌劑，孢子可以存活多年。在感染后，破傷風(fēng)的潛伏期自3天至21天不等。大多數(shù)病例發(fā)生在14天內(nèi)。
圖1 破傷風(fēng)梭菌示意圖
破傷風(fēng)患者自臨床恢復(fù)后不能因此獲得免疫，而破傷風(fēng)疫苗是預(yù)防破傷風(fēng)的有效途徑，自應(yīng)用以來明顯降低了破傷風(fēng)的發(fā)病率，對破傷風(fēng)疾病的預(yù)防起到了極其重要的作用。破傷風(fēng)疫苗免疫后產(chǎn)生的抗破傷風(fēng)毒素的抗體在抵御破傷風(fēng)方面發(fā)揮著重要作用。除疫苗制劑的主動免疫外，破傷風(fēng)的被動免疫也在臨床中用于破傷風(fēng)的短期應(yīng)急預(yù)防，其給藥后破傷風(fēng)毒素抗體效價水平變化是評價保護(hù)性的替代指標(biāo)。因而破傷風(fēng)毒素抗體效價水平的檢測具備重要的意義。
本文將介紹幾種常用的破傷風(fēng)抗體檢測方法：
PART 01
體內(nèi)實驗（小鼠毒素中和試驗 ）
體內(nèi)中和試驗（In Vivo Neutralization Assay, IVN）是檢測抗破傷風(fēng)抗體的一種方法，被認(rèn)為是衡量血清中生物活性抗毒素抗體的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。
體內(nèi)中和試驗通過在活體動物（通常是小鼠）中評估血清樣本對破傷風(fēng)毒素的中和能力來檢測抗破傷風(fēng)抗體。這種方法能夠檢測到低至0.001國際單位每毫升（IU/mL）的中和抗體。
實驗通常在小鼠中進(jìn)行，將一系列稀釋的測試血清與致死劑量的破傷風(fēng)毒素一起孵化，然后注射到小鼠體內(nèi)。通過與國際參考血清（如TE-3 WHO參考血清）標(biāo)準(zhǔn)化，可以得到以IU/mL為單位的結(jié)果。具體實驗步驟見下圖：
圖2 體內(nèi)小鼠試驗示意圖
小鼠體內(nèi)中和法測定破傷風(fēng)抗體效價存在一定的優(yōu)劣勢。
優(yōu)勢如下：
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特異性強(qiáng)：小鼠體內(nèi)中和法被認(rèn)為是檢測特異抗體效價的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因為它能真實地反映樣本的中和效價。
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靈敏度高：該方法能夠檢測到非常低水平的中和抗體，例如每毫升血清中0.001國際單位（IU/mL）的中和抗體。
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真實性：由于其基于生物學(xué)活性的測量，該方法能夠提供關(guān)于抗體中和能力的直接證據(jù)。
劣勢如下：
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成本高：小鼠體內(nèi)中和法需要使用大量的實驗動物，導(dǎo)致成本較高。
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勞動密集：該方法操作復(fù)雜，需要大量的人力來進(jìn)行動物飼養(yǎng)和實驗操作。
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時間消耗長：完成一次小鼠體內(nèi)中和試驗需要較長的時間，通常需要幾周。
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結(jié)果變異性：由于實驗動物的個體差異，以及終點選擇的主觀性（如疾病癥狀或死亡），可能會導(dǎo)致結(jié)果的變異性。
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缺乏國際標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議：目前沒有國際上標(biāo)準(zhǔn)化的協(xié)議，使得不同實驗室之間的結(jié)果難以直接比較。
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依賴于動物：該方法依賴于活體動物的使用，這在倫理和操作上都存在一定的限制。
PART 02
體外方法
破傷風(fēng)抗體與破傷風(fēng)毒素或類毒素之間的相互作用可以通過體外試驗來測量，包括被動血凝試驗、放射免疫測定、標(biāo)準(zhǔn)或改良的酶聯(lián)免疫吸附測定（ ELISAs）以及基于磁珠的免疫熒光測定。除了放射免疫測定外，這些技術(shù)都簡單、靈敏、快速且成本低廉，但它們通常比體內(nèi)中和方法的特異性要低。因此，體外技術(shù)的結(jié)果應(yīng)該仔細(xì)解釋，并在可能的情況下與體內(nèi)中和方法進(jìn)行驗證。
圖3 試驗示意圖
被動凝集試驗
被動血凝（Hemagglutination, HA）試驗是一種簡單的體外測定方法，其中破傷風(fēng)毒素（Tetanus Toxin, TT）致敏的紅細(xì)胞在破傷風(fēng)抗體存在時會發(fā)生凝集。HA試驗的可靠性受到限制，因為它主要測量IgM，而IgM并不能中和破傷風(fēng)毒素。HA試驗與中和試驗之間的相關(guān)性是多變的。在含有高或中等滴度的血清中，HA試驗與中和試驗之間存在良好的相關(guān)性，但在低滴度時，由于檢測到非功能性抗體，HA試驗可能會高估結(jié)果。
放射免疫測定（RIA）試驗
放射免疫測定（Radioimmunoassay, RIA）試驗已被用來測定破傷風(fēng)抗體的效價。RIA試驗有幾種可能的修改方式：破傷風(fēng)毒素（TT）可以與不溶性吸附劑（如纖維素或瓊脂糖）結(jié)合，或者像酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試驗中那樣被動吸附到塑料表面。特異性抗體與抗原免疫吸附劑結(jié)合，并通過測量與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合的同位素標(biāo)記的人類抗球蛋白的結(jié)合來定量。RIA試驗的靈敏度高，結(jié)果與HA試驗獲得的值有很好的相關(guān)性。然而，RIA試驗所需的試劑和設(shè)備昂貴，且該技術(shù)只能由經(jīng)過高度培訓(xùn)的人員使用。
常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）
酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是檢測抗破傷風(fēng)IgG抗體最常用的測定方法。 如采用間接ELISA 法（測試血清中的抗體與固定相（微孔板孔表面）上的破傷風(fēng)毒素（TT）結(jié)合）。通常認(rèn)為抗體濃度高于0.16-0.2 IU/mL時，間接ELISA與中和試驗之間存在良好相關(guān)性。與中和試驗相比，間接ELISA在低于這個范圍時，可能高估了抗體水平。預(yù)測臨床保護(hù)的最低ELISA值為0.16 IU/mL。
ELISA對破傷風(fēng)抗毒素水平的高估和特異性不足可能歸因于幾個因素，例如抗體對抗原制劑中的污染物的非特異性結(jié)合，或者識別在抗原制劑中可能產(chǎn)生的非生物學(xué)重要表位。檢測到親和力較低的抗毒素，不足以在體內(nèi)中和毒素，也可能有助于抗體水平的高估。 另一種解釋可能是檢測到不對稱的、功能上單價的IgG抗體，這些抗體的毒素中和活性有限。
圖4 酶聯(lián)免疫吸附實驗，間接ELISA法示意圖
改良的ELISA法
改良的ELISA法檢測破傷風(fēng)抗體是一種經(jīng)過優(yōu)化的檢測技術(shù)，它提供了一種快速、準(zhǔn)確且具有良好特異性和重復(fù)性的破傷風(fēng)抗體檢測方法，對于評估破傷風(fēng)疫苗的免疫原性和破傷風(fēng)毒素抗體藥的有效性提供重要的信息。改良ELISA法有多種方法，如競爭ELISA法，雙抗原夾心ELISA，化學(xué)發(fā)光法，基于磁珠技術(shù)等?？苫趯嶋H需要，選擇合適的方法。
PART 03
小結(jié)
血清學(xué)指標(biāo)-抗毒素（類毒素）特異性IgG 被認(rèn)為與保護(hù)性最為相關(guān)，開發(fā)和驗證科學(xué)的方法對于破傷風(fēng)疫苗/破傷風(fēng)抗體藥有效性的評估非常重要。
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參考文獻(xiàn)：
[1] The immunological basis for immunization series: module3: tetanus (Immunological basis for immunization series; module 3). WHO. 2018
[2] 中國藥典通則3508 破傷風(fēng)抗毒素效價測定法（小鼠試驗法）
[3] Wang Y, Wu C, Yu J, Lin S, Liu T, Zan L, Li N, Hong P, Wang X, Jia Z, Li J, Wang Y, Zhang M, Yuan X, Li C, Xu W, Zheng W, Wang X, Liao HX. Structural basis of tetanus toxin neutralization by native human monoclonal antibodies. Cell Rep. 2021 May 4;35(5):109070. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109070. PMID: 33951441.
