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熙寧小課-第103期 | mRNA疫苗的臨床免疫原性分析
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時間:2023-04-20

新冠的爆發(fā)讓mRNA技術從各種疫苗技術中脫穎而出,也推動了mRNA疫苗的商業(yè)化,輝瑞/BioNTech以及Moderna的兩款mRNA疫苗的相繼獲批上市,mRNA疫苗未來將會有更廣闊的發(fā)展空間。隨著越來越多的mRNA疫苗應用于臨床,疫苗的有效性和安全性評價也更加需要重視。




01

mRNA疫苗作用機制


mRNA疫苗將特異性抗原的部分mRNA引入人體細胞內,利用宿主細胞的蛋白質合成機制產生抗原,從而激發(fā)特異性免疫反應,并達到形成免疫記憶的效果。mRNA疫苗可分為預防性傳染病mRNA疫苗和治療性腫瘤mRNA疫苗。預防性傳染病mRNA疫苗在細胞中表達傳染病特異抗原,激活機體的免疫應答反應產生抗體,從而達到預防傳染性疾病的目的。治療性腫瘤mRNA疫苗是在機體細胞內合成腫瘤特異性抗原蛋白,誘導機體產生免疫應答反應,從而有針對性地攻擊腫瘤細胞,達到腫瘤預防或治療的作用。


圖1  mRNA疫苗作用機制


如圖所示,mRNA疫苗從合成到啟動免疫反應主要經歷以下三個階段,包括體外mRNA合成、細胞內加工和啟動免疫反應。mRNA疫苗被封裝在脂質體(LNP)載體納米顆粒中,并被抗原呈遞細胞內吞,mRNA從載體逃逸后釋放到細胞質中,然后由核糖體翻譯成抗原蛋白。隨后,內源性抗原被蛋白酶體降解為多肽,由MHC I呈遞并激活細胞毒性T細胞(CD8+T細胞)。此外,分泌的抗原可被細胞吸收,在內切體內降解,并通過MHC II類蛋白在細胞表面呈現給輔助性T細胞。最后,輔助性T細胞(CD4+T細胞)刺激B細胞產生抗病原體的中和抗體。




02

mRNA疫苗優(yōu)勢

· 有效性高:一次給藥,可表達多種抗原,免疫原性強,可激活細胞免疫和體液免疫;


· 安全性高:不存在潛在宿主感染風險或整合到宿主細胞基因組中的誘變風險,自我降解可通過正常生理過程代謝;


· 研發(fā)周期短:平臺技術復用性強,能更有效應對突發(fā)疫情或病毒變異;


· 低生產成本+快生產速度:體外轉錄合成制備,無需細胞培養(yǎng)和動物源基質,生產線可復用可快速制備。通常傳統疫苗的生產至少需要6個月時間,而mRNA疫苗由于高產量的體外轉錄反應和快速制劑的特點,在實現標準化生產的情況下30天內就可產成,疫苗的時效性在應對突發(fā)疫情尤其是病毒變異時分外重要。





03

mRNA疫苗應用

mRNA技術在理論上可以生產出任何一種人類所需的蛋白質。除新冠疫苗外,mRNA疫苗廣泛應用于傳染病預防研究,如預防呼吸道合胞病毒(RSV)、巨細胞病毒(CMV)、寨卡病毒、流感病毒、狂犬病毒等傳染性疾病領域。Moderna宣布RSV mRNA疫苗mRNA-1345的三期臨床達到主要終點,對于2種或2種以上癥狀的保護率為83.7%,mRNA-1345為表達pre-F蛋白的單價mRNA疫苗,進行單次免疫,根據該數據,Moderna將于2023年遞交上市申請。


mRNA疫苗能夠更精準地靶向特異免疫目標。篩選出腫瘤相關抗原進行測序、分析,將對應的mRNA序列合成疫苗,使自身細胞生產出抗原標識物,并以此激發(fā)對應的特異性免疫。由于mRNA疫苗中的編碼可以進行編輯,可以準確地控制產生的抗原蛋白種類和序列,選擇僅僅在腫瘤細胞中才會分泌的抗原蛋白標志物作為靶點,避免誤傷其他正常細胞,使特異免疫精準地靶向腫瘤。此外,mRNA 疫苗能夠激發(fā)針對細胞的T細胞免疫,在殺傷腫瘤細胞方面擁有更高的效率。


mRNA-4157(個體化腫瘤疫苗)是針對每位腫瘤患者量身定制的個體化腫瘤疫苗,能夠容納高達34個編碼新抗原的mRNA序列,注射到患者體內后,mRNA上攜帶的指令就會告訴患者的癌細胞表達所選的新表位,進而患者自身的免疫系統能夠識別出癌細胞并精準的殺傷腫瘤細胞。Merck與Moderna聯合開發(fā)的個體化癌癥疫苗mRNA-4157正與Merck的PD-1抗體(Keytruda)聯用,應用于完全切除的黑色素瘤患者的輔助治療。臨床試驗結果顯示,與單獨使用Keytruda相比,聯合治療將復發(fā)或死亡的風險降低了44%, FDA 已授予“突破性治療”認定,用于高危黑色素瘤患者接受完全切除術后的輔助治療,此次認定意味著mRNA療法可能成為治療黑色素瘤和其他癌癥的新興前沿療法。





04

mRNA疫苗的免疫原性評估

圖2  疫苗研發(fā)中涉及的不同類型的生物分析方法


免疫原性是疫苗研發(fā)各個階段需要關注的重要指標,包括疫苗的免疫原性評價以及有效性評價。以輝瑞/BioNTech新冠mRNA疫苗為例,COVID-19 mRNA疫苗的有效性和安全性分析如下:


· ELISA/Luminex檢測血清中抗體針對COVID-19病毒Spike蛋白及RBD區(qū)域的結合作用;


· 疫苗誘導的中和抗體應答通過COVID-19病毒中和試驗和假病毒中和試驗檢測;


· IFN-γ ELISPOT檢測PBMC的免疫響應(使用Spike重組糖蛋白分別刺激疫苗接種前后同一志愿者體內PBMC,對比接種后和接種前細胞分泌IFN-γ程度);


· 流式細胞術檢測CD4+ T cell及CD8+ T cell經Spike重組糖蛋白刺激后產生的IL-2、IFN-γ及TNFα;


· MSD/Luminex驗證細胞因子檢測;


圖3  mRNA疫苗臨床生物分析內容

(以輝瑞/BioNTech新冠mRNA疫苗為例)


圖4  四種新冠疫苗誘導的體液和細胞免疫


圖5  BNT162b2誘導IgG抗體和病毒中和抗體


結合抗體和中和抗體常用于mRNA疫苗的免疫原性和保護效力分析,BNT162b2疫苗1/2期臨床試驗結果發(fā)現BNT162b2產生了強烈新冠抗體反應,SARS-CoV-2人體血清中有50%的中和幾何平均滴度(GMT)是COVID-19人群恢復期樣本(HCS)中觀察到的3.3倍。BNT162b2誘導血清中和了22種含有SARS-CoV-2S變體的假病毒。


圖6  BNT162b2誘導T細胞分泌細胞因子


細胞免疫的作用機制主要是包括兩個方面,致敏T細胞的直接殺傷作用,以及其通過釋放細胞因子的協同作用,因此mRNA疫苗細胞免疫分析為細胞免疫表型及胞內細胞因子檢測、監(jiān)測疫苗接種后的安全性,通常采用流式細胞術(FACS)或酶聯免疫斑點技術(ELISPOT)來進行檢測。


BNT162b2臨床試驗中,大多數參與者具有強烈的IFNγ或IL-2陽性CD8+和CD4+T細胞反應,并在9周后的整個觀察期內仍能檢測到。一周后,表位特異性CD8+早期分化的效應器記憶表型T細胞占總循環(huán)CD8+的0.02-2.92%,8周后檢測到0.01-0.28%??傊珺NT162b2在人體內可誘導產生中和抗體以及多特異性細胞免疫反應。





05

總結與經驗

熙寧生物|精翰生物擁有完善的技術平臺和豐富的經驗,可為mRNA疫苗臨床前以及臨床階段提供一站式的生物分析服務。包括mRNA基因水平檢測(qPCR),表達產物水平和功能活性檢測(Bioassay/ELISA/MSD),抗病毒結合抗體和抗病毒中和抗體檢測(Cell Based Assay/LBA),細胞免疫反應(ELISPOT/FACS)以及細胞因子(ELISA/MSD/Luminex)等,高效助力mRNA藥物研發(fā)。


熙寧生物 免疫分析平臺介紹

支持產品類型:

蛋白藥(單抗,雙抗,融合蛋白,ADC,融合蛋白等),細胞和基因治療藥物


可檢測項目:

藥代動力學(PK),藥效學(PD)

抗藥抗體(ADA),中和抗體(NAb)

生物標志物(Biomarker),細胞因子

熙寧生物 流式細胞術檢測細胞亞群經驗

? 檢測CD45、CD3、CD4、CD8、CD19,CD56等指標 (TBMNK)

? 檢測CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD25、CD127等指標 (TBNK, Treg)

? 檢測CD3、CD4、CD8、CD16、CD56,Ki67等指標 (Ki67)

? 檢測CD3、CD4、CD8、中心記憶細胞、效應記憶細胞( CD45RA, CCR7) 

? 檢測CD3、CD4、CD8、PD-1、LAG3、TIM3、 中心記憶細胞、效應記憶細胞 

? 檢測CD3、CD4、CD8、Treg、NK、 Ki67等指標 (細胞增殖)

? 檢測CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、HLA-DR (T細胞激活) 

? 檢測CD3、CD4、CD8、4-1BB、ICOS (T細胞激活) 

? 檢測BCMA、CD19 、CD38、CD138、CD56、CD117 

? 檢測骨髓克隆性漿細胞含量(CD45、CD19、D38、CD56、CD138) 

? 檢測淋巴細胞亞群分型(CD19 、CD22 、CD38、CD138、CD56、CD117)

? 檢測淋巴細胞亞群分型(BCMA、CD19 、CD38、CD138、CD56、CD117) 

? 檢測CD45、CD38、CD138、CD19、CD117、CD81、BCMA、Kappa、Lambda、CD56、CD27 

? 檢測CD19、CD45、CD38、CD56、CD20、CD138、CD269、k輕鏈、λ輕鏈 

? 檢測 CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD25、CD127、CD45RA、CCR7、PD-1、TIGIT、TIM3、LAG3、CD27、CD69、CD38、HLR-DR、4-1BB





06

參考文獻

1. mRNA-based modalities for infectious disease management


2. 2020 White Paper on Recent Issues in Bioanalysis: Vaccine Assay Validation, qPCR Assay Validation, QC for CAR-T Flow Cytometry, NAb Assay Harmonization and ELISpot.


3. mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases


4. Development of functionally relevant potency assays for monovalent and multivalent vaccines delivered by evolving technologies


5. BNT162b2 vaccine induces neutralizing antibodies and poly-specific T cells in humans


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