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熙寧小課-第111期 | 淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤中的應(yīng)用及要點梳理
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時間:2023-08-04

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)是利用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術(shù),在臨床樣品分析中,可以支持包括免疫分型/淋巴細(xì)胞亞群分析、磷酸化/甲基化/泛素化蛋白、受體占位、胞內(nèi)因子、微小殘留病監(jiān)測等多種檢測分析。在淋巴細(xì)胞亞群分析中,最普遍常用的指標(biāo)包括對CD3+T淋巴細(xì)胞,CD3+CD4+輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞,CD3+CD8+抑制/殺傷T淋巴細(xì)胞,CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞,CD3-(CD16+CD56)+NK淋巴細(xì)胞,以及CD3+CD4+CD25+CD127-/low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。此外,單核細(xì)胞中的CD14+陽性細(xì)胞群也會在部分項目中與淋巴細(xì)胞亞群相結(jié)合,因此共同分析,即TBMNK。


近期,中國醫(yī)藥質(zhì)量管理協(xié)會醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)量管理專業(yè)委員會發(fā)布了一篇《淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤中應(yīng)用的專家共識》(以下簡稱《共識》),我們歸納總結(jié)了其中的關(guān)鍵要點,結(jié)合熙寧生物|精翰生物在淋巴細(xì)胞亞群檢測眾多項目累積的經(jīng)驗,做一個簡要梳理,拋磚引玉,歡迎交流討論。


在淋巴細(xì)胞亞群檢測中,TBNK推薦的單抗為CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56,Treg檢測的單抗為CD4、CD25、CD3、CD127。CD3+T細(xì)胞標(biāo)記為CD3+,CD4+T細(xì)胞標(biāo)記為CD3+CD4+,CD8+T細(xì)胞標(biāo)記為 CD3+CD8+,B細(xì)胞標(biāo)記為CD3-CD19+,NK細(xì)胞標(biāo)記為CD3-(CD16+CD56)+,Treg細(xì)胞的標(biāo)記為CD3+CD4+CD25+FoxP3+或CD3+CD4+CD25+CD127-/low。T細(xì)胞表面CD127的低表達(dá)與T細(xì)胞質(zhì)內(nèi)FoxP3的高表達(dá)具有良好的相關(guān)性,且以CD127為標(biāo)志進(jìn)行檢測的方法明顯優(yōu)于以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)FoxP3為標(biāo)志的檢測方法[1-3],因此也可以使用CD127替代FoxP3進(jìn)行Treg細(xì)胞的分析。


使用CD25+FoxP3+和CD25+CD127-/low兩種方式標(biāo)記Treg,熙寧生物|精翰生物均具有豐富的項目經(jīng)驗?;谖鯇幧飢精翰生物的項目經(jīng)驗而言,使用CD25+CD127-/low標(biāo)記Treg的方法可在室溫/2-8℃,兩種儲存條件下穩(wěn)定儲存12天(days,下文簡稱“D”);使用CD25+FoxP3+標(biāo)記Treg的方法可在室溫穩(wěn)定儲存4D,在2-8℃穩(wěn)定儲存5D。綜上,使用CD127替代FoxP3標(biāo)記Treg在方法的穩(wěn)定性方面具有極大的提升,這與《共識》中的結(jié)論也是統(tǒng)一的。熙寧生物|精翰生物使用CD127-/low CD25+標(biāo)記Treg的部分穩(wěn)定性數(shù)據(jù)展示如下:


表1  使用CD127-/low CD25+標(biāo)記Treg的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

注:該方法已經(jīng)過熙寧生物|精翰生物內(nèi)部全驗證,可直接支持樣品分析?!癈D127-/lowCD25+%” 為CD127-/lowCD25+占父群的比例,即Treg占CD4+T細(xì)胞亞群的比例。A,室溫儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù),與基線相比%CV范圍為:0.9%-11.2%。B,2-8℃儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù),與基線相比%CV范圍為:0.3%-10.1%。


淋巴細(xì)胞亞群檢測可以通過單平臺法或雙平臺法[4]進(jìn)行,取樣時,首選乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空管采集外周靜脈血標(biāo)本,并在24h內(nèi)進(jìn)行檢測。送檢時間超過30h應(yīng)該采用肝素鈉或枸櫞酸鈉抗凝,可在室溫下穩(wěn)定保存至48h,若送檢時間超過48h,應(yīng)該使用流式細(xì)胞檢測專用的樣本保存液或樣本保存管,可穩(wěn)定保存至14D。熙寧生物|精翰生物已有經(jīng)過全驗證的TBMNK檢測方法,使用特殊采血管進(jìn)行樣品采集,可直接用于支持臨床樣本中CD3+T淋巴細(xì)胞,CD3+CD4+輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞,CD3+CD8+抑制/殺傷T淋巴細(xì)胞,CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞,CD3-CD16+/CD56+NK淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例,和CD14+單核細(xì)胞占單核細(xì)胞的比例,及各個細(xì)胞亞群在外周血中濃度的檢測。已驗證可在室溫/2-8℃,兩種儲存條件下穩(wěn)定儲存14D,部分穩(wěn)定性數(shù)據(jù)展示如下:


表2  人全血中TBMNK穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

注:使用特殊采血管采集的人全血,室溫儲存14天后,與基線相比%CV范圍為0.3%-13.8%。


在健康成年人外周血中,T、B、NK及Treg細(xì)胞在今年的多項研究中均有發(fā)布,針對我國不同地區(qū)、年齡等健康人群均提供了相應(yīng)的參考區(qū)間,見下表:


表3  健康成年人外周血TBNK淋巴細(xì)胞參考區(qū)間

注:我國九省(湖北、河南、廣東、吉林、山東、山西、江蘇、浙江、四川)20~60歲健康成人TBNK淋巴細(xì)胞參考區(qū)間的研究結(jié)果,供參考。


表4  健康成年人外周血Treg細(xì)胞參考區(qū)間


血液腫瘤作為造血干細(xì)胞異常的惡性腫瘤,疾病的多種因素會影響免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖及分化,使外周血的淋巴細(xì)胞數(shù)量與功能產(chǎn)生異常,導(dǎo)致免疫功能失調(diào),因此對血液腫瘤患者進(jìn)行規(guī)范的淋巴細(xì)胞亞群檢測十分必要。淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤患者中的應(yīng)用包括以下幾個方面:


1.淋巴細(xì)胞亞群分析可以支持部分血液腫瘤的篩查(如急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞增殖性疾病(CLPD)等)

當(dāng)出現(xiàn)以下情況:

① B或NK淋巴細(xì)胞顯著增高;

② CD3+CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞或CD3+CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞明顯增高;

③ CD4/CD8比值大于10:1或小于1:10;

④ CD3+%+CD19+% +(CD16+CD56)+%明顯大于或小于(100 ± 5)%、CD4+%+CD8+%明顯大于或小于CD3+%(變化范圍為5%~10%);

在排除標(biāo)本、儀器、設(shè)門、試劑及反應(yīng)性改變等因素后,需要考慮標(biāo)本中存在異常淋巴細(xì)胞,并結(jié)合臨床進(jìn)行血液腫瘤的篩查。血液腫瘤常見的淋巴細(xì)胞亞群改變見下圖:


注:A表示T淋巴細(xì)胞群比例增高;B表示B淋巴細(xì)胞群比例增高;C表示NK細(xì)胞群比例增高;D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴細(xì)胞比例之和小于95%,存在不表達(dá)CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴細(xì)胞;F表示CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞群比例大致正常;G表示CD4+T淋巴細(xì)胞群比例降低,CD8+T淋巴細(xì)胞群比例增高;H表示CD4+T淋巴細(xì)胞群比例增高,CD8+T淋巴細(xì)胞群比例降低:I表示中CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞群比例增高:J表示 CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞群比例增高。


血液腫瘤淋巴細(xì)胞亞群篩查與隨訪路徑見下圖:

注:MICM表示形體學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)分型


2.腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)警及預(yù)后評估

CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和比例與患者的完全緩解(CR)率、無復(fù)發(fā)生存期(RFS)和總生存期(OS)呈正相關(guān),而Treg的數(shù)量和比例與CR率、RFS和OS呈負(fù)相關(guān) [5-9] 。在AML患者中,NK細(xì)胞數(shù)量和比例與CR率、RFS、OS呈正相關(guān) [10] 。


3.合并感染風(fēng)險預(yù)警

感染是血液腫瘤患者的常見并發(fā)癥,當(dāng)CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)<500個/μL時,血液腫瘤患者機會性感染風(fēng)險會大幅升高[11]。初診時Treg細(xì)胞比例升高的血液腫瘤患者,其住院期間感染率明顯增加[12]。


4.造血干細(xì)胞移植后免疫重建監(jiān)測及GVHD預(yù)防

造血干細(xì)胞移植(HSCT)后造血能力持久恢復(fù)與免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)密切相關(guān),主要表現(xiàn)為免疫細(xì)胞數(shù)量的增加和細(xì)胞功能狀態(tài)的恢復(fù)。NK細(xì)胞一般移植后2~3周可恢復(fù),CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞一般移植后1~3月恢復(fù),CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞恢復(fù)通常需要1年以上。CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞移植后恢復(fù)時間不定,短至3個月,長至1年半以上。Treg細(xì)胞在移植早期通常比例非常低,移植晚期逐漸增多。


具有負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)功能的Treg細(xì)胞隨GVHD等級的增加呈下降趨勢,有望成為預(yù)測急性GVHD(發(fā)生于移植后100d內(nèi))和慢性GVHD(發(fā)生于移植100d后)的特異性指標(biāo)[13-14]。因此異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)患者在早期植入階段(輸注后2~4周)、移植后早期階段(輸注后1~3月)、移植后晚期階段(輸注后3月以后)都建議行淋巴細(xì)胞亞群檢測。


5.CAR-T治療患者的規(guī)范化管理和評估

定期監(jiān)測CAR-T治療患者體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞水平、腫瘤負(fù)荷、免疫功能(主要包括淋巴細(xì)胞亞群的比例和數(shù)量)和相關(guān)不良反應(yīng)(細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性等),是治療后病情評估的重要手段[15-16]?;颊呋剌擟AR-T細(xì)胞后,可通過FCM監(jiān)測外周血中CAR-T細(xì)胞的比例和數(shù)量,有條件的實驗室還可開展熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(qRT-PCR)監(jiān)測CAR-T細(xì)胞增殖水平。


淋巴亞群檢測也被推薦與CAR-T細(xì)胞監(jiān)測同時進(jìn)行[16]。有研究通過檢測患者CAR?T細(xì)胞回輸后第15天的外周血淋巴細(xì)胞水平,發(fā)現(xiàn)低水平的淋巴細(xì)胞數(shù)(<0.67×109/L)是患者的不良預(yù)后因素,顯著影響病情緩解[17]。有研究者提出,具有中央記憶T細(xì)胞和干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞表型的CAR-T細(xì)胞,在體內(nèi)有更強的增殖能力及更持久的抗腫瘤效應(yīng)[18-19]。對于CAR-T細(xì)胞治療的患者,有條件的情況下,可以進(jìn)行CAR-T細(xì)胞的精細(xì)亞群分析和長期隨訪。


6.血液腫瘤患者藥物治療指導(dǎo)

對于靶向治療B-NHL的CD20單抗,B細(xì)胞是否完全清除可以用于評估CD20單抗的治療反應(yīng)和療效[20-22]。對于免疫功能嚴(yán)重受損的患者(經(jīng)過放化療治療或合并HIV感染等),患者在治療過程中嚴(yán)重感染的頻率顯著增加,建議根據(jù)患者的CD4+T細(xì)胞數(shù)量制定治療策略;對于移植及個體化免疫治療患者,則可以參考CD4+/CD8+細(xì)胞比值;對于治療期間合并感染的患者,更需要關(guān)注NK細(xì)胞或者CD8+T細(xì)胞。


7.動態(tài)監(jiān)測與隨訪時機的選擇

健康人群的參考區(qū)間可能不能有效評估血液腫瘤患者的免疫功能,建議建立患者個體化的淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果的基線,并規(guī)律、動態(tài)的監(jiān)測其變化趨勢。血液腫瘤患者常伴有免疫功能失衡,初診時檢測患者的淋巴細(xì)胞亞群,有助于判斷免疫功能的初始狀態(tài)。放化療、免疫治療及靶向治療期間患者可呈周期性改變,檢測淋巴細(xì)胞亞群變化可用于評估患者治療期間免疫功能恢復(fù)情況及腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險。建議在治療結(jié)束后半年內(nèi)每3個月跟蹤檢測,半年后每6個月進(jìn)行隨訪。造血干細(xì)胞移植后患者在移植后第14天、第21天、1個月、2個月、3個月、6個月、1年、2年隨訪建議檢測淋巴細(xì)胞亞群。建議連續(xù)監(jiān)測患者CAR-T細(xì)胞回輸前1天、回輸后第4天、第7天、第14天、第28天外周血淋巴細(xì)胞亞群變化情況,及治療后2個月、3個月、6個月隨訪,見下圖:


血液腫瘤淋巴細(xì)胞亞群檢測路徑圖


淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤中具有重要的臨床意義和廣泛的應(yīng)用前景,通過TBNK、Treg這些指標(biāo),可以評估血液腫瘤患者免疫狀況,為疾病診斷、分型,治療方案的選擇、化療后感染預(yù)防,疾病轉(zhuǎn)歸等提供實驗室依據(jù),以及為血液腫瘤患者的個性化治療提供參考。


熙寧生物 | 精翰生物流式團(tuán)隊由30余名經(jīng)驗豐富的人員組成,配備BD流式細(xì)胞儀、Beckman流式細(xì)胞儀、Cytek光譜流式細(xì)胞儀等儀器和設(shè)備,支持過包括抗體類藥物、基因與細(xì)胞治療藥物、小分子創(chuàng)新藥等各類新藥的流式分析檢測,其中抗體藥物>20個,基因與細(xì)胞治療藥物>10 個,小分子創(chuàng)新藥>10 個,臨床試驗>40 個,更是支持國內(nèi)第一款I(lǐng) 類新藥的CAR-T產(chǎn)品- 藥明巨諾倍諾達(dá)?(瑞基奧侖賽注射液)的樣本檢測分析工作。平臺能夠支持包括免疫細(xì)胞亞群分型檢測,細(xì)胞治療產(chǎn)品的PK/PD 分析,抗體藥物的受體占位分析,PD指標(biāo)蛋白磷酸化、甲基化、乙?;瘷z測,胞內(nèi)因子檢測等。尤其在血液腫瘤淋巴細(xì)胞亞群檢測中具有大量的實戰(zhàn)經(jīng)驗,歡迎咨詢溝通。

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