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熙寧小課-第121期 | 多彩多色—mIHC技術(shù)助力抗腫瘤藥物臨床開發(fā)
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時間:2023-11-03

多重免疫組化(multiplex immunohistochemistry, mIHC)是近年來興起的一種多重熒光標記的免疫組化染色方法,是腫瘤藥物臨床開發(fā)過程和臨床前研究的重要工具,已被眾多藥企廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫微環(huán)境研究、新靶點探索,以及更多新的免疫治療方案的挖掘。



PART 01

mIHC技術(shù)簡介及基本原理


多色免疫熒光有多種技術(shù)路線,目前最為成熟的方法是基于酪胺信號放大技術(shù)(tyramide signal amplificatio, TSA)。該技術(shù)利用二抗上標記的辣根過氧化物酶(HRP)催化底物過氧化氫,使加入反應(yīng)體系的帶有熒光標記的酪胺被氧化為活化狀態(tài),并能與組織樣本中富含的酪氨酸殘基共價結(jié)合,從而在特定的抗原位置形成熒光信號。該信號不受微波影響,因此可通過微波加熱去除抗體再進行下一輪的一抗、二抗孵育(圖1, 2)[1]。


基于TSA技術(shù)可在組織切片上孵育多種不同標記物抗體,再結(jié)合高分辨率多通道的熒光掃描技術(shù)和分析軟件,可以對多種生物標記物在腫瘤微環(huán)境中的表達狀態(tài)進行檢測分析,從而揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展,腫瘤免疫微環(huán)境,或者藥物的藥效等多種生理病理過程。


圖1 mIHC技術(shù)原理示意圖


圖2 mIHC實驗流程




PART 02

mIHC技術(shù)的優(yōu)點和局限性


傳統(tǒng)免疫組織化學 (IHC) 是組織病理學中廣泛使用的診斷技術(shù)。然而,該技術(shù)存在許多局限,比如觀察者間的高變異性,以及每個組織切片僅標記一個指標。相比較傳統(tǒng)的單染免疫組化,mIHC可以提供大量多靶標的空間位置、定量分析、細胞類型分布等大量信息,因此在臨床研究上受到越來越多的重視。


mIHC技術(shù)可以提供更大信息量,更高精準度,

同時需要更少組織量

傳統(tǒng)IHC技術(shù)想要獲得多個靶點信息需要在多張切片上進行染色,并將染色結(jié)果對比著觀察,易受切片不連續(xù)的影響造成偏差。而mIHC可在一張切片上同時獲得關(guān)于細胞定量、細胞亞群分型、細胞空間排列等多個類型的信息,結(jié)果更準確,同時也能極大的節(jié)省樣本需求量。與明場多重染色相比,前者需要使用不同種屬的一抗來避免二抗的交叉反應(yīng),而mIHC由于每一輪染料標記上后都會通過微波加熱去除結(jié)合的抗體再進行下一輪標記,故使用的抗體不受種屬限制,選擇起來更加便利。此外,mIHC染色結(jié)果配合智能圖像分析軟件使用,定量評估細胞密度、表型和定位等,相比傳統(tǒng)病理醫(yī)生的人工判讀更加精準。


mIHC技術(shù)有更好的預(yù)測價值

一項基于文獻研究(總計超8000例患者)的Mata分析顯示,當采用傳統(tǒng)免疫組化、腫瘤突變負荷(tumor mutational burden, TMB)、基因表達譜(gene expression profiling, GEP)或腫瘤微環(huán)境來預(yù)測免疫檢查點抑制劑的療效時,基于mIHC的腫瘤免疫微環(huán)境分析具有最高的預(yù)測價值,甚至比前三者聯(lián)合的預(yù)測效果還要好(圖3),充分展示了mIHC技術(shù)可視化、定量、高通量的優(yōu)勢[3]。

圖3 mIHC預(yù)測效果最佳


 mIHC技術(shù)操作復(fù)雜,投入高

mIHC技術(shù)發(fā)展至今也存在一定的局限性,譬如由于需要反復(fù)多輪的抗體孵育和熒光染料標記使得整個實驗流程耗時較長,且當標記的熒光種類較多時不可避免地會出現(xiàn)波長相近熒光信號的串擾。同時,mIHC染色結(jié)果需要通過掃描儀捕獲并利用智能軟件分析處理,要得到的巨大信息量的數(shù)據(jù)對實驗室配套硬件設(shè)施的存儲能力及計算能力要求均較高,實驗成本也較高。因此如果需要獲得高質(zhì)量的mIHC結(jié)果,要在全自動化的染色儀器進行染色,盡量減少手工操作帶來的不確定性。同時,必須配備智能化的分析軟件,并對分析過程嚴格控制,從而實現(xiàn)對圖像數(shù)據(jù)的標準化分析。



PART 03

mIHC技術(shù)的應(yīng)用


目前,mIHC技術(shù)已經(jīng)在多個領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用,如腫瘤免疫微環(huán)境的變化、受試者用藥前后的相關(guān)靶標的表達差異、免疫細胞的浸潤情況、三級淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)研究、信號通路中關(guān)聯(lián)靶點的空間分析等。下文將展示幾個例子以供大家參考。


用藥前后腫瘤免疫微環(huán)境變化

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)包括腫瘤相關(guān)巨噬細胞、成纖維細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、髓源性抑制細胞、肥大細胞等,是多種類型細胞相互作用形成的動態(tài)網(wǎng)絡(luò),尤為適合采用善于分析復(fù)雜樣本的mIHC技術(shù)進行研究。例如通過定量分析HER2陽性乳腺癌患者腫瘤組織間質(zhì)和瘤內(nèi)浸潤的免疫細胞(包括CD8+的細胞毒T細胞、CD4+/FoxP3-的輔助T細胞、FoxP3+的調(diào)節(jié)性T細胞、CD20+的B細胞及CD68陽性的巨噬細胞)的密度,可揭示不同細胞亞群對免疫治療的響應(yīng)程度、探尋療效預(yù)測的標記物。當與基因組分析方法聯(lián)合對經(jīng)抗PD-1藥物治療的黑色素瘤患者進行研究時,發(fā)現(xiàn)PTEN突變往往伴隨著不良預(yù)后,這也與免疫抑制的腫瘤微環(huán)境相關(guān)[2]。


此外,將mIHC技術(shù)運用于靶向治療的各個階段觀察免疫細胞,可為治療提供更精準的路線圖。如在轉(zhuǎn)移的肺癌患者中通過panel: DAPI/CK/CD14/CD8/CD3的染色發(fā)現(xiàn)藥物治療響應(yīng)階段可見活化的T細胞和減少的巨噬細胞,而耐藥階段則出現(xiàn)相反的現(xiàn)象[2]


在一項針對可手術(shù)的非小細胞肺癌新輔助治療(納武利尤單抗單獨或聯(lián)用伊匹木單抗)II期臨床試驗研究中,采用mIHC技術(shù)檢測了治療前后的腫瘤組織樣本,發(fā)現(xiàn)在兩種藥物聯(lián)合治療后,CD3+及CD3+CD8+的TILs顯著增加,且出現(xiàn)CD3+CD8+CD45RO+記憶TILs密度增高的趨勢。與此同時,聯(lián)合用藥也可誘導(dǎo)不同免疫細胞亞群的浸潤,如CD3+CD8+PD-1+的T細胞、CD3+CD8+GZB+的T細胞、CD3+CD8-FoxP3+的T細胞、CD68+及CD68+PD-L1+的細胞。而單獨使用納武利尤單抗治療前后,免疫細胞亞群沒有實質(zhì)性的改變??梢妋IHC技術(shù)可用于觀測治療后的免疫響應(yīng)程度,從而對預(yù)后做出評估,有助于個體化用藥/治療的實施[4]


圖4 利用mIHC觀測治療前后多個靶點蛋白的表達水平變化


腫瘤相關(guān)免疫細胞空間位置與預(yù)后價值

利用空間分布研究惡性細胞和腫瘤相關(guān)免疫細胞(TAIC)之間的相互作用對于確定腫瘤進展、復(fù)發(fā)或生存的可能性至關(guān)重要。免疫細胞的分布模式影響癌癥患者的預(yù)后在多種腫瘤中被證實,如乳腺癌,肺癌,結(jié)直腸癌。


在一項研究[5]中,使用包含在5個mIHC panel(圖5)中的 23 種標記物(包括 T 細胞、B 細胞、免疫檢查點和骨髓細胞標記物)分析了一組腫瘤組織芯片(TMA),其中包含從大量 I-III 期 NSCLC 患者中獲取的腫瘤樣本。根據(jù)23種標記物針對相關(guān)的腫瘤細胞和免疫細胞進行分析,通過將細胞分布模式與細胞距離相結(jié)合,確定了四組細胞免疫模式:

· 第 1 組:與惡性細胞中位距離較近的混合模式;

· 第 2 組:與惡性細胞中位距離較遠的混合模式;

· 第 3 組:與惡性細胞的中位距離接近的非混合模式;

· 第 4 組:與惡性細胞的中位距離較遠的非混合模式。


進一步的研究發(fā)現(xiàn),第 2 組與其他組相比占比較高,在 36.8% 的患者中觀察到這一組,其特征是 T 細胞表型密度高,但惡性細胞表達的免疫檢查點密度低,這表明第 2 組模式可能顯示了該類型腫瘤的炎癥效應(yīng)。第 1 組(與惡性細胞中位距離接近的混合模式),在 23.6% 的樣本中觀察到;第 3 組(與惡性細胞中值距離接近的非混合模式),在 9.0% 的樣本中觀察到。相比之下,第 4 組總體顯示 T 細胞密度最低,但惡性細胞表達的免疫檢查點密度最高,表明第 4 組模式顯示“冷”腫瘤的特征。生存曲線結(jié)果顯示,在 ADC 中,CD3 + CD8 + 細胞毒性 T 細胞、CD3 + CD8 + GZB + 激活的細胞毒性 T 細胞和巨噬細胞與惡性細胞的近距離與遠距離相比,與更好的 OS 相關(guān),這表明這些細胞與細胞的接近,減輕了抑制細胞的抑制作用。惡性細胞與 B7-H3 + T 細胞的距離較近與 OS 較差相關(guān)(圖5)。該研究表明空間表型研究可以很好的研究腫瘤微環(huán)境及患者預(yù)后的情況,為新診療策略的提出奠定了基礎(chǔ)。

圖5 利用mIHC panel分組分析腫瘤患者免疫細胞空間位置與預(yù)后相關(guān)性


三級淋巴結(jié)構(gòu)與預(yù)后

三級淋巴結(jié)構(gòu)(tertiary lymphoid structures, TLSs)是免疫腫瘤學領(lǐng)域的一個熱門話題,它在影響腫瘤微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用。TLS已在多種實體瘤類型中被發(fā)現(xiàn),當存在于腫瘤微環(huán)境中時與更好的生存相關(guān)。mIHC技術(shù)可用于評估腫瘤組織的三級淋巴結(jié)構(gòu),并在三級淋巴結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮了重要作用[6]

一項研究[7]分析了從 328 名接受抗 PD-1 或抗 PD-L1 抗體治療的患者獲得的治療前存檔腫瘤樣本,研究發(fā)現(xiàn)105 例患者 (32%) 中存在 TLS,其中 84 例具有成熟 TLS (25.6%)。在成熟 TLS 組中, 84 名患者中有 31 名 (36.9%; 95% CI, 26.6%–48.1%) 獲得客觀緩解,而 21 名TLS 不成熟患者中有 4 名獲得客觀緩解 (19.3%; 95% CI, 5.4%–41.9%),223 名TLS 陰性患者中有 43 名獲得客觀緩解(19%;95% CI,14.3%–25.1%),三組中的比例有顯著差異(p=0.015),據(jù)此可見TLS的存在與免疫治療的預(yù)后有明顯相關(guān)性(圖6)。


圖6 成熟的 TLS 可評估癌癥患者免疫治療預(yù)后


總之,多重免疫組化可實現(xiàn)在一張FFPE切片上同時、原位地檢測多個指標。該方法通過結(jié)合多種標志物在細胞上的表達狀況識別不同細胞亞群,同時結(jié)合智能分析軟件,統(tǒng)計各個組織區(qū)域中細胞類型、 密度、空間位置關(guān)系等信息,獲得大量原來單標染色不具備的細胞類型,密度,空間距離等信息,從而使研究者對于目標區(qū)域的認識上升到一個新的維度,在藥物臨床和臨床前的研究方面得到了廣泛應(yīng)用。



PART 04

熙寧生物|精翰生物mIHC平臺簡介


熙寧生物|精翰生物組織病理實驗室mIHC平臺配備了高標準的徠卡Bond Rx全自動免疫組化染色機、Akoya PhenoImager全光譜成像系統(tǒng)以及Halo數(shù)字病理圖像分析平臺等重量級設(shè)備及分析系統(tǒng),可提供自動化,高質(zhì)量的mIHC研究全流程解決方案。從panel設(shè)計,panel驗證,以及樣本檢測等提供全方位的支持??蔀閺V大藥企提供高品質(zhì)的臨床前、臨床試驗階段的組織樣本mIHC檢測,歡迎垂詢。

圖7 熙寧生物|精翰生物mIHC平臺主要儀器設(shè)備


參考文獻:

[1] 孫文佳,周建婭,周建英.多色標記免疫組織化學染色和免疫熒光染色在肺癌免疫治療中的研究進展[J].中國肺癌雜志, 2021, 24(1):7.

[2] Li W, Yuan X, Xu B, et al. Applications of multiplexed immunohistochemistry/immunofluorescence and multispectral imaging technology in the field of tumor immunotherapy[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2020, 29(10).

[3] Lu S, et al. Comparison of Biomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1 Checkpoint Blockade: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol. 2019 Aug 1;5(8):1195-1204.

[4] Cascone T, et al. Neoadjuvant nivolumab or nivolumab plus ipilimumab in operable non-small cell lung cancer: the phase 2 randomized NEOSTAR trial. Nat Med. 2021 Mar;27(3):504-514.

[5] Parra ER, Zhang J, Jiang M, Tamegnon A, Pandurengan RK, Behrens C, Solis L, Haymaker C, Heymach JV, Moran C, Lee JJ, Gibbons D, Wistuba II. Immune cellular patterns of distribution affect outcomes of patients with non-small cell lung cancer. Nat Commun. 2023 Apr 25;14(1):2364.

[6] Sautès-Fridman C, Petitprez F, Calderaro J, Fridman WH. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2019 Jun;19(6):307-325.

[7] Vanhersecke L, Brunet M, Guégan JP, Rey C, Bougouin A, Cousin S, Moulec SL, Besse B, Loriot Y, Larroquette M, Soubeyran I, Toulmonde M, Roubaud G, Pernot S, Cabart M, Chomy F, Lefevre C, Bourcier K, Kind M, Giglioli I, Sautès-Fridman C, Velasco V, Courgeon F, Oflazoglu E, Savina A, Marabelle A, Soria JC, Bellera C, Sofeu C, Bessede A, Fridman WH, Loarer FL, Italiano A. Mature tertiary lymphoid structures predict immune checkpoint inhibitor efficacy in solid tumors independently of PD-L1 expression. Nat Cancer. 2021 Aug;2(8):794-802.

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