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多重免疫組化（multiplex immunohistochemistry, mIHC）是近年來(lái)興起的一種多重?zé)晒鈽?biāo)記的免疫組化染色方法，是腫瘤藥物臨床開(kāi)發(fā)過(guò)程和臨床前研究的重要工具，已被眾多藥企廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫微環(huán)境研究、新靶點(diǎn)探索，以及更多新的免疫治療方案的挖掘。

PART 01

多色免疫熒光有多種技術(shù)路線，目前最為成熟的方法是基于酪胺信號(hào)放大技術(shù)（tyramide signal amplificatio, TSA）。該技術(shù)利用二抗上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化底物過(guò)氧化氫，使加入反應(yīng)體系的帶有熒光標(biāo)記的酪胺被氧化為活化狀態(tài)，并能與組織樣本中富含的酪氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，從而在特定的抗原位置形成熒光信號(hào)。該信號(hào)不受微波影響，因此可通過(guò)微波加熱去除抗體再進(jìn)行下一輪的一抗、二抗孵育(圖1, 2)^[1]。

基于TSA技術(shù)可在組織切片上孵育多種不同標(biāo)記物抗體，再結(jié)合高分辨率多通道的熒光掃描技術(shù)和分析軟件，可以對(duì)多種生物標(biāo)記物在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)分析，從而揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展，腫瘤免疫微環(huán)境，或者藥物的藥效等多種生理病理過(guò)程。

圖1 mIHC技術(shù)原理示意圖

圖2 mIHC實(shí)驗(yàn)流程

PART 02

傳統(tǒng)免疫組織化學(xué) (IHC) 是組織病理學(xué)中廣泛使用的診斷技術(shù)。然而，該技術(shù)存在許多局限，比如觀察者間的高變異性，以及每個(gè)組織切片僅標(biāo)記一個(gè)指標(biāo)。相比較傳統(tǒng)的單染免疫組化，mIHC可以提供大量多靶標(biāo)的空間位置、定量分析、細(xì)胞類型分布等大量信息，因此在臨床研究上受到越來(lái)越多的重視。

傳統(tǒng)IHC技術(shù)想要獲得多個(gè)靶點(diǎn)信息需要在多張切片上進(jìn)行染色，并將染色結(jié)果對(duì)比著觀察，易受切片不連續(xù)的影響造成偏差。而mIHC可在一張切片上同時(shí)獲得關(guān)于細(xì)胞定量、細(xì)胞亞群分型、細(xì)胞空間排列等多個(gè)類型的信息，結(jié)果更準(zhǔn)確，同時(shí)也能極大的節(jié)省樣本需求量。與明場(chǎng)多重染色相比，前者需要使用不同種屬的一抗來(lái)避免二抗的交叉反應(yīng)，而mIHC由于每一輪染料標(biāo)記上后都會(huì)通過(guò)微波加熱去除結(jié)合的抗體再進(jìn)行下一輪標(biāo)記，故使用的抗體不受種屬限制，選擇起來(lái)更加便利。此外，mIHC染色結(jié)果配合智能圖像分析軟件使用，定量評(píng)估細(xì)胞密度、表型和定位等，相比傳統(tǒng)病理醫(yī)生的人工判讀更加精準(zhǔn)。

一項(xiàng)基于文獻(xiàn)研究（總計(jì)超8000例患者）的Mata分析顯示，當(dāng)采用傳統(tǒng)免疫組化、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden, TMB）、基因表達(dá)譜（gene expression profiling, GEP）或腫瘤微環(huán)境來(lái)預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效時(shí)，基于mIHC的腫瘤免疫微環(huán)境分析具有最高的預(yù)測(cè)價(jià)值，甚至比前三者聯(lián)合的預(yù)測(cè)效果還要好（圖3），充分展示了mIHC技術(shù)可視化、定量、高通量的優(yōu)勢(shì)^[3]。

圖3 mIHC預(yù)測(cè)效果最佳

mIHC技術(shù)發(fā)展至今也存在一定的局限性，譬如由于需要反復(fù)多輪的抗體孵育和熒光染料標(biāo)記使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程耗時(shí)較長(zhǎng)，且當(dāng)標(biāo)記的熒光種類較多時(shí)不可避免地會(huì)出現(xiàn)波長(zhǎng)相近熒光信號(hào)的串?dāng)_。同時(shí)，mIHC染色結(jié)果需要通過(guò)掃描儀捕獲并利用智能軟件分析處理，要得到的巨大信息量的數(shù)據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室配套硬件設(shè)施的存儲(chǔ)能力及計(jì)算能力要求均較高，實(shí)驗(yàn)成本也較高。因此如果需要獲得高質(zhì)量的mIHC結(jié)果，要在全自動(dòng)化的染色儀器進(jìn)行染色，盡量減少手工操作帶來(lái)的不確定性。同時(shí)，必須配備智能化的分析軟件，并對(duì)分析過(guò)程嚴(yán)格控制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)圖像數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化分析。

PART 03

目前，mIHC技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，如腫瘤免疫微環(huán)境的變化、受試者用藥前后的相關(guān)靶標(biāo)的表達(dá)差異、免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、三級(jí)淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)研究、信號(hào)通路中關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)的空間分析等。下文將展示幾個(gè)例子以供大家參考。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，是多種類型細(xì)胞相互作用形成的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，尤為適合采用善于分析復(fù)雜樣本的mIHC技術(shù)進(jìn)行研究。例如通過(guò)定量分析HER2陽(yáng)性乳腺癌患者腫瘤組織間質(zhì)和瘤內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞（包括CD8+的細(xì)胞毒T細(xì)胞、CD4+/FoxP3-的輔助T細(xì)胞、FoxP3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD20+的B細(xì)胞及CD68陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞）的密度，可揭示不同細(xì)胞亞群對(duì)免疫治療的響應(yīng)程度、探尋療效預(yù)測(cè)的標(biāo)記物。當(dāng)與基因組分析方法聯(lián)合對(duì)經(jīng)抗PD-1藥物治療的黑色素瘤患者進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)PTEN突變往往伴隨著不良預(yù)后，這也與免疫抑制的腫瘤微環(huán)境相關(guān)^[2]。

此外，將mIHC技術(shù)運(yùn)用于靶向治療的各個(gè)階段觀察免疫細(xì)胞，可為治療提供更精準(zhǔn)的路線圖。如在轉(zhuǎn)移的肺癌患者中通過(guò)panel: DAPI/CK/CD14/CD8/CD3的染色發(fā)現(xiàn)藥物治療響應(yīng)階段可見(jiàn)活化的T細(xì)胞和減少的巨噬細(xì)胞，而耐藥階段則出現(xiàn)相反的現(xiàn)象^[2]。

在一項(xiàng)針對(duì)可手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌新輔助治療（納武利尤單抗單獨(dú)或聯(lián)用伊匹木單抗）II期臨床試驗(yàn)研究中，采用mIHC技術(shù)檢測(cè)了治療前后的腫瘤組織樣本，發(fā)現(xiàn)在兩種藥物聯(lián)合治療后，CD3+及CD3+CD8+的TILs顯著增加，且出現(xiàn)CD3+CD8+CD45RO+記憶TILs密度增高的趨勢(shì)。與此同時(shí)，聯(lián)合用藥也可誘導(dǎo)不同免疫細(xì)胞亞群的浸潤(rùn)，如CD3+CD8+PD-1+的T細(xì)胞、CD3+CD8+GZB+的T細(xì)胞、CD3+CD8-FoxP3+的T細(xì)胞、CD68+及CD68+PD-L1+的細(xì)胞。而單獨(dú)使用納武利尤單抗治療前后，免疫細(xì)胞亞群沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的改變?？梢?jiàn)mIHC技術(shù)可用于觀測(cè)治療后的免疫響應(yīng)程度，從而對(duì)預(yù)后做出評(píng)估，有助于個(gè)體化用藥/治療的實(shí)施^[4]。

圖4 利用mIHC觀測(cè)治療前后多個(gè)靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)水平變化

利用空間分布研究惡性細(xì)胞和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞（TAIC）之間的相互作用對(duì)于確定腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)或生存的可能性至關(guān)重要。免疫細(xì)胞的分布模式影響癌癥患者的預(yù)后在多種腫瘤中被證實(shí)，如乳腺癌，肺癌，結(jié)直腸癌。

在一項(xiàng)研究^[5]中，使用包含在5個(gè)mIHC panel（圖5）中的 23 種標(biāo)記物（包括 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、免疫檢查點(diǎn)和骨髓細(xì)胞標(biāo)記物）分析了一組腫瘤組織芯片（TMA），其中包含從大量 I-III 期 NSCLC 患者中獲取的腫瘤樣本。根據(jù)23種標(biāo)記物針對(duì)相關(guān)的腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)行分析，通過(guò)將細(xì)胞分布模式與細(xì)胞距離相結(jié)合，確定了四組細(xì)胞免疫模式：

· 第 1 組：與惡性細(xì)胞中位距離較近的混合模式；

· 第 2 組：與惡性細(xì)胞中位距離較遠(yuǎn)的混合模式；

· 第 3 組：與惡性細(xì)胞的中位距離接近的非混合模式；

· 第 4 組：與惡性細(xì)胞的中位距離較遠(yuǎn)的非混合模式。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，第 2 組與其他組相比占比較高，在 36.8% 的患者中觀察到這一組，其特征是 T 細(xì)胞表型密度高，但惡性細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)密度低，這表明第 2 組模式可能顯示了該類型腫瘤的炎癥效應(yīng)。第 1 組（與惡性細(xì)胞中位距離接近的混合模式），在 23.6% 的樣本中觀察到；第 3 組（與惡性細(xì)胞中值距離接近的非混合模式），在 9.0% 的樣本中觀察到。相比之下，第 4 組總體顯示 T 細(xì)胞密度最低，但惡性細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)密度最高，表明第 4 組模式顯示“冷”腫瘤的特征。生存曲線結(jié)果顯示，在 ADC 中，CD3 + CD8 + 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞、CD3 + CD8 + GZB + 激活的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與惡性細(xì)胞的近距離與遠(yuǎn)距離相比，與更好的 OS 相關(guān)，這表明這些細(xì)胞與細(xì)胞的接近，減輕了抑制細(xì)胞的抑制作用。惡性細(xì)胞與 B7-H3 + T 細(xì)胞的距離較近與 OS 較差相關(guān)（圖5）。該研究表明空間表型研究可以很好的研究腫瘤微環(huán)境及患者預(yù)后的情況，為新診療策略的提出奠定了基礎(chǔ)。

圖5 利用mIHC panel分組分析腫瘤患者免疫細(xì)胞空間位置與預(yù)后相關(guān)性

三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures, TLSs）是免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱門話題，它在影響腫瘤微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用。TLS已在多種實(shí)體瘤類型中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在于腫瘤微環(huán)境中時(shí)與更好的生存相關(guān)。mIHC技術(shù)可用于評(píng)估腫瘤組織的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)，并在三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮了重要作用^[6]。

一項(xiàng)研究^[7]分析了從 328 名接受抗 PD-1 或抗 PD-L1 抗體治療的患者獲得的治療前存檔腫瘤樣本，研究發(fā)現(xiàn)105 例患者 (32%) 中存在 TLS，其中 84 例具有成熟 TLS (25.6%)。在成熟 TLS 組中， 84 名患者中有 31 名 (36.9%; 95% CI, 26.6%–48.1%) 獲得客觀緩解，而 21 名TLS 不成熟患者中有 4 名獲得客觀緩解 (19.3%; 95% CI, 5.4%–41.9%)，223 名TLS 陰性患者中有 43 名獲得客觀緩解（19%；95% CI，14.3%–25.1%），三組中的比例有顯著差異（p=0.015），據(jù)此可見(jiàn)TLS的存在與免疫治療的預(yù)后有明顯相關(guān)性（圖6）。

圖6 成熟的 TLS 可評(píng)估癌癥患者免疫治療預(yù)后

總之，多重免疫組化可實(shí)現(xiàn)在一張F(tuán)FPE切片上同時(shí)、原位地檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)。該方法通過(guò)結(jié)合多種標(biāo)志物在細(xì)胞上的表達(dá)狀況識(shí)別不同細(xì)胞亞群，同時(shí)結(jié)合智能分析軟件，統(tǒng)計(jì)各個(gè)組織區(qū)域中細(xì)胞類型、 密度、空間位置關(guān)系等信息，獲得大量原來(lái)單標(biāo)染色不具備的細(xì)胞類型，密度，空間距離等信息，從而使研究者對(duì)于目標(biāo)區(qū)域的認(rèn)識(shí)上升到一個(gè)新的維度，在藥物臨床和臨床前的研究方面得到了廣泛應(yīng)用。

PART 04

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