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熙寧小課-第135期 | 免疫組庫測(cè)序打開藥物研發(fā)新視野(一):什么是免疫組庫測(cè)序?
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時(shí)間:2024-03-08

免疫組庫測(cè)序在各種疾病研究中顯示出良好的前景,如自身免疫性疾病、傳染病、腫瘤的診斷、監(jiān)測(cè)和治療等,免疫組庫測(cè)序。作為當(dāng)下備受矚目的前沿技術(shù)之一,正為我們揭開免疫系統(tǒng)奧秘的面紗。免疫組庫測(cè)序不僅讓我們能夠深入了解身體對(duì)抗病原體的方式,更為理解免疫相關(guān)疾病和藥物研發(fā)提供了新的視角。本文旨在向大家介紹什么是免疫組庫測(cè)序,無論您是否對(duì)生物科學(xué)有著濃厚興趣,本文都將為您打開一扇通往免疫學(xué)世界的門,讓我們一起探尋人類抵御疾病的絕妙之處吧!


PART 01

免疫組庫測(cè)序測(cè)的是什么?


免疫系統(tǒng)保護(hù)人體免受病原體的傷害,這種保護(hù)主要為大量淋巴細(xì)胞受體、T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)和B細(xì)胞受體(B-cell receptor, BCR)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。免疫受體是抗原結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域,共有七條鏈參與形成受體,T細(xì)胞包括由α鏈和β鏈編碼的αβT細(xì)胞或由γ鏈和δ鏈編碼的γδT細(xì)胞,B細(xì)胞受體由重鏈和κ鏈或重鏈和λ鏈編碼,還有雙α和雙γT細(xì)胞,這些受體有助于確定抗原特異性。在任何特定時(shí)刻,一個(gè)人的免疫系統(tǒng)都由獨(dú)特的TCR和BCR組成,這反映了免疫系統(tǒng)對(duì)毒素或外來物質(zhì)的反應(yīng)能力(圖1) 。

免疫組庫測(cè)序是指檢測(cè)BCR及TCR,B細(xì)胞上負(fù)責(zé)識(shí)別并特異結(jié)合抗原的膜表面免疫球蛋白,我們稱為BCR,BCR是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成;T細(xì)胞上特異識(shí)別并特異結(jié)合抗原的分子為TCR,TCR分子也屬于免疫球蛋白超家族, 由α、β或γ、δ兩條肽鏈組成。編碼BCR/TCR的4個(gè)基因簇V(可變區(qū))、D(高變區(qū))、J(編碼蛋白連接v、c區(qū)的結(jié)合區(qū))、C(恒定區(qū)) , B/T細(xì)胞通過V(D)J重組,使BCR/TCR基因序列極為豐富。V(D)J序列多樣性的集合我們稱為為免疫組庫(Immune Repertoire, IR),通過高通量測(cè)序,可一次性獲得大量免疫組庫數(shù)據(jù),從而實(shí)現(xiàn)免疫組庫高通量測(cè)序。

圖1 抗原特異性淋巴細(xì)胞受體的結(jié)構(gòu)和多樣性[1]

注:上圖顯示了抗體的重鏈和輕鏈,它們通過二硫鍵連接(粗藍(lán)線);跨細(xì)胞膜的TCR是由αβ鏈或γδ鏈組成的異二聚體。上圖中由V(D)J基因組成的可變(V)區(qū),V區(qū)由CDR區(qū)和框架區(qū)(FR)組成。CDR1、CDR2和CDR3顯示為不同的顏色(分別為黃色、藍(lán)色和綠色)。下部(白色區(qū)域)是一個(gè)保守的恒定區(qū)域

圖2 淋巴細(xì)胞受體庫多樣性的機(jī)制[1]

注:在淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中,BCR重鏈或TCRβ(δ)鏈進(jìn)行VDJ基因的重排,而IgL鏈或α(γ)鏈在重排中缺少D基因;然后,將重新排列的V-DJ或V-J序列連接到C基因片段。最后,兩條獨(dú)立的鏈被組裝成獨(dú)特的受體蛋白。胚系基因V(D)JC經(jīng)歷核苷酸的重排、插入和刪除,導(dǎo)致受體庫的多樣性


PART 02

TCR重排和基因結(jié)構(gòu)


TCR 是由 α 和 β 鏈 (TCRαβ) 或 γ 鏈和 δ 鏈 (TCRγδ) 組合形成的跨膜糖蛋白異二聚體。它們僅在 T 細(xì)胞中表達(dá),其中大多數(shù) (95%) 為 TCRαβ 異二聚體。TCRα 和 TCRβ 胞外結(jié)構(gòu)域由肽段識(shí)別至關(guān)重要的可變結(jié)構(gòu)域(Vα 和 Vβ)和恒定結(jié)構(gòu)域(Cα 和 Cβ)組成。

編碼α鏈和β鏈(分別為 TRA 和 TRB)的基因由多個(gè)不連續(xù)的片段組成:TRA 和 TRB 的可變區(qū) (V) 和連接區(qū) (J),以及 TRB 的多樣性 (D) 片段。TCR 基因經(jīng)歷 V(D)J 重組:α 鏈的 V 和 J 片段以及 β 鏈的 V、D 和 J 片段間重組,形成功能可變的編碼序列。然后,該序列與 C 片段重組,并最終轉(zhuǎn)錄為功能性 TRA 或 TRB 鏈轉(zhuǎn)錄本。TCRα和TCRβ鏈的結(jié)構(gòu)中都包含三個(gè)高變區(qū),分別稱為互補(bǔ)決定區(qū)1、2和3(CDR1、CDR2、CDR3)。CDR1 和 CDR2 區(qū)域由 V 段胚系基因編碼,CDR3區(qū)由連接區(qū)V(D)J基因編碼,片段間伴有核苷酸(N)隨機(jī)插入/刪除,為該區(qū)域提供高度的變異性。這些過程最終產(chǎn)生由特定α和β鏈組成的 TCR,這些鏈決定了受體的特異性(圖3)。

圖3 TCR的結(jié)構(gòu)組成[2]



PART 03

BCR重排和基因結(jié)構(gòu)


人類的抗體是蛋白質(zhì)復(fù)合物,其基本單位是一對(duì)二硫鍵連接的重鏈蛋白和一條對(duì)應(yīng)的輕鏈(圖3)。重鏈和輕鏈的N末端區(qū)域的序列高度可變,并且是抗體的抗原結(jié)合部位。蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域被稱為恒定區(qū)域。輕鏈有兩種類型,kappa (IgK) 和lambda (IgL),而重鏈(IgH)有五種主要的類型(IgM、IgD、IgG、IgA和IgE),其中IgG有四種亞型,IgA有兩種亞型。

為了識(shí)別不同的抗原,在每個(gè)B細(xì)胞中,Ig基因經(jīng)歷兩次多樣化過程,包括抗原非依賴性和抗原依賴性過程,最后形成總的BCR抗體庫。


非抗原依賴的胚系重排過程

在暴露于抗原之前,V(D)J重組發(fā)生在網(wǎng)膜、胎兒肝臟或成人骨髓中的B細(xì)胞發(fā)育過程中,IgV外顯子重排組裝形成一級(jí)抗體庫。在這種不依賴抗原的過程中,胚系可變區(qū)(V)、高變區(qū)(D)和連接區(qū)(J)基因片段以有序的方式在Ig基因座中重排組裝而成,首先將D和J片段連接在一起,然后選擇V片段連接到新產(chǎn)生的D-J產(chǎn)物,從可變(V)、高變區(qū)(D)和連接區(qū)(J)基因片段胚系序列中組裝編碼其免疫球蛋白重鏈的抗原結(jié)合區(qū)的基因。在連接過程中,對(duì)基因片段的末端進(jìn)行核酸外切酶消化,并在片段連接處添加非模板隨機(jī)堿基(N)。初級(jí)BCR庫的多樣性來自V/D/J基因片段的數(shù)量,以及連接點(diǎn)的插入和刪除(indel)突變。在IgV結(jié)構(gòu)域中,該序列可進(jìn)一步分為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和框架區(qū)(FR)。FR和CDR1/2來自V基因片段,而CDR3覆蓋包含V-D-J連接的序列(圖3)。因此,CDR3是最多樣化的序列,通常在抗原識(shí)別過程中發(fā)揮最重要的作用,但由可變基因片段編碼的另外兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(CDR1和CDR2)也可以顯著促進(jìn)抗原特異性。從肽序列方面來看,CDR3有以下幾個(gè)特征,即,以半胱氨酸(C)開始,以苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)結(jié)束。 在表達(dá)功能性IgH后,κ或λ免疫球蛋白輕鏈基因座上發(fā)生類似的V和J片段重排。

在暴露于抗原之前,個(gè)體B細(xì)胞抗體庫的遺傳復(fù)雜性來源于V、(D)和J片段的重排組合,編碼抗體重鏈或輕鏈的CDR3區(qū)域片段連接處的多樣化,以及重鏈和輕鏈的配對(duì)組合。早期對(duì)這些機(jī)制可能產(chǎn)生的不同抗體的數(shù)量的粗略估計(jì)為大于1011。這個(gè)數(shù)字應(yīng)該是被低估了,因?yàn)榭乖碳は翨細(xì)胞激活體細(xì)胞超突變?yōu)榭贵w序列多樣化提供了更多可能,該過程是在整個(gè)重排的V(D)J序列中產(chǎn)生新的點(diǎn)突變,形成克隆后代,其抗體可能對(duì)抗原具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力;另外受體編輯等罕見過程通過V基因片段的二次重排和替換,為抗體庫的生成提供了進(jìn)一步的可能。在人類群體水平上,抗體庫的更多遺傳多樣性源于免疫球蛋白等位基因突變和免疫球蛋白基因座內(nèi)擴(kuò)增或刪除的拷貝數(shù)變異。

V基因片段的遺傳結(jié)構(gòu)包括編碼大部分前導(dǎo)肽的上游外顯子,其次是短內(nèi)含子、編碼其余前導(dǎo)肽和V片段的第二外顯子。在未重排的人類胚系基因座中,V、D和J區(qū)域彼此相隔數(shù)千堿基,由單個(gè)外顯子(κ或λ)或幾個(gè)外顯子編碼的恒定區(qū)域(重鏈不同類型)位于J片段下游數(shù)千堿基處,除λ基因座外,其中一些J片段散布在最上游的恒定區(qū)域之間。在重鏈和輕鏈基因座重排過程中產(chǎn)生長(zhǎng)度約為400個(gè)堿基緊湊的V(D)J基因。

根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫(www.IMGT.org)報(bào)道,14q32人類IGH基因座的序列分析表明,人類具有123-129個(gè)IGHV基因片段,其中43-46個(gè)能夠形成功能重排;27個(gè)IGHD基因片段(23個(gè)功能片段);以及9個(gè)IGHJ片段(6個(gè)功能性片段)。2p11的IGK基因座在大多數(shù)個(gè)體中編碼76個(gè)IGKV片段(31-36個(gè)功能性片段)和5個(gè)IGKJ基因片段(5個(gè)功能性片段),而22q11的IGL基因座包含73-74個(gè)IGLV片段(29-33個(gè)功能性片段)和7-11個(gè)IGLJ片段(4-5個(gè)功能性片段)。隨著技術(shù)的發(fā)展,識(shí)別Ig基因新變異的步伐已經(jīng)加快,這表明目前分析的變異只代表了所有人類群體中可能存在的總變異的一部分。


抗原依賴的二次多樣化

抗原刺激后,BCR經(jīng)歷另一次多樣化,包括IgH類開關(guān)重組(CSR)和IgV體細(xì)胞超突變(SHM),這兩種突變都是由激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(AID)引發(fā)。在CSR中,BCR可以從IgM轉(zhuǎn)換到另一種同種型,包括IgG、IgA或IgE。而在SHM中,AID可以在IgV外顯子處啟動(dòng)突變或INDEL。表達(dá)突變多樣性BCR的B細(xì)胞在生發(fā)中心的次級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)中進(jìn)行親和力的選擇,該過程為親和力成熟的過程。伴隨著這些抗原依賴性過程,幼稚B細(xì)胞進(jìn)一步分化為分泌抗體的漿細(xì)胞或記憶B細(xì)胞。此時(shí),B細(xì)胞庫表達(dá)高級(jí)抗體庫,其中包含不同類別的高效抗體。人類抗體的體細(xì)胞超突變主要發(fā)生在次級(jí)淋巴組織的特殊微環(huán)境中,其中B細(xì)胞可以接觸抗原、特異樹突狀細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞,以及通過可溶性介質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞接觸刺激B細(xì)胞。在急性抗原刺激(如流感疫苗接種)后觀察到的人漿母細(xì)胞在IGHV片段中通常顯示出5%-15%的突變水平,而記憶B細(xì)胞顯示出略低的突變水平。在特殊的情況下,如HIV感染者長(zhǎng)期暴露于病毒抗原免疫系統(tǒng)紊亂時(shí),可以觀察到更高的突變水平(超過30%)。突變事件主要集于前導(dǎo)序列的上游至V(D)J重排的區(qū)域,并在將J片段與恒定區(qū)域之間的內(nèi)含子區(qū)中逐漸變少。



圖4 抗體結(jié)構(gòu)和基因編碼[3]

注:免疫球蛋白重鏈基因座的胚系(未重排)基因組DNA結(jié)構(gòu)如圖頂部所示,顯示了 V、D 和 J 基因片段的串聯(lián)排列(非等比例縮放)。胚系κ或λ輕鏈基因座位于左側(cè),具有未重排的V和J片段。胚系DNA的逐步重排使重鏈D和J基因片段的連接,隨后V片段與D-J產(chǎn)物的連接,產(chǎn)生編碼重鏈可變區(qū)的DNA。在重排過程中,基因片段的末端經(jīng)過核酸外切酶消化,并在片段末端添加隨機(jī)的非模板堿基,以在編碼互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)的VDJ連接區(qū)產(chǎn)生額外的序列多樣性,其通常是抗體重鏈中對(duì)抗原特異性影響最大的區(qū)域。在輕鏈基因座中發(fā)生了類似的V和J基因重排過程,VJ連接多樣化,從而產(chǎn)生重排的輕鏈基因。重鏈和輕鏈的恒定區(qū)(重鏈結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3,輕鏈結(jié)構(gòu)域CL)由下游外顯子編碼,這些外顯子通過mRNA剪接與重排的V(D)J基因連接。抗體結(jié)構(gòu)中蛋白鏈連接的二硫鍵用黑線顯示。


本篇內(nèi)容給大家介紹了什么是免疫組庫測(cè)序,詳細(xì)介紹了BCR/TCR基因重排的過程,下篇將為大家介紹免疫組庫測(cè)序的方法,敬請(qǐng)期待。


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