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酶聯免疫斑點技術（Enzyme Linked Immunospot Assay，簡稱ELISPOT）是細胞免疫學研究中最敏感的檢測方法，可以在單細胞水平對抗體分泌細胞(如B細胞)及細胞因子分泌細胞（如T細胞）進行檢測，可達20-25斑點/100萬細胞，由于該方法是進行抗原刺激后免疫細胞的功能性檢測，因此也具有極佳的生理相關性。
ELISPOT常用于疫苗領域藥效學評估, 是mRNA感染性疫苗和mRNA/DC腫瘤疫苗藥效學評估中關鍵的技術方法，也是AAV based藥物細胞免疫原性評估重要的技術手段。
ELISPOT基本原理是通過免疫細胞和對應刺激物進行共培養(yǎng)，類似于ELISA雙抗夾心法對有刺激反應的免疫細胞進行檢測。由于免疫細胞激活機理的復雜性性，根據免疫細胞的來源選擇，刺激物的類型，刺激方式的不同會衍生出不同的應用方向，以及不同靈敏度的ELISPOT檢測方法，簡要的技術流程如圖1所示：
圖1. ELSIPOT檢測流程圖
在基因治療藥物的臨床生物分析實踐中，細胞免疫原性檢測有諸多的難點：
1. ELISPOT通常需要刺激物和對應陽性PBMC才能進行方法學驗證，在實際的方法學驗證過程中由于刺激物對應的陽性PBMC不易獲取，的因此有些檢測機構的做法是，方法并不進行驗證。即使進行驗證也通常采用CEF作為刺激物，篩選健康人PBMC作為陽性PBMC進行方法學的精密度，穩(wěn)定性以及穩(wěn)固性驗證，從而證明整體平臺體系的可靠性。熙寧生物秉持嚴謹可靠的方法開發(fā)驗證質量要求，除采用CEF刺激陽性PBMC作為主體驗證外，基于對于基因治療藥物原理的了解，在正式樣品分析前會進行專屬于該基因治療藥物的特異性較差驗證，如對于AAV治療藥物，會基于AAV病毒載體存在預存的陽性PBMC，對于AAV藥物的細胞免疫原性檢測，篩選出健康人群體中的陽性PBMC，進行AAV衣殼蛋白多肽庫的交叉驗證，確保在進行樣品分析前檢測方法的可靠性。
2. ELISPOT的檢測結果會受到樣品PBMC本身的質量的影響較大，如果PBMC分離或者保藏不當，很可能會失去功能學活性，導致假陰性的結果。ELISPOT檢測結果同時受到樣品PBMC本身免疫狀態(tài)影響，如在采集時處于免疫活躍狀態(tài)，會出現較多的背景斑點，檢測結果得到的斑點數會是假陰性。因此，為了得到更加真實可靠的實驗結果，進行樣品分析時，如圖2所示，對于每一個樣品均會設置CD3刺激組來監(jiān)控PBMC的功能活性，Medium分組來監(jiān)控PBMC的免疫背景，在此基礎上進行特定抗原的檢測分析。
圖2. ELISPOT樣品分析體系
3. ELISPOT作為最為靈敏的檢測技術，結果受到的影響因素較多，樣品進行分析時往往會出現異常的數據，很多供應商只匯報檢測斑點結果，并不能有效的進行數據解讀。熙寧生物對于ELISPOT檢測技術和細胞免疫具有深刻的理解，基于CD3組的方法學驗證數據得到了PBMC最小響應閾值MIR，基于Medium組的方法學驗證數據得到最小效應限LOD，結合實踐情況，會對每一個檢測數據進行充分的結果，，確保數據的科學性和合理性。
在基因治療藥物的臨床生物分析實踐，細胞免疫原性檢測有以下關鍵點：
1. 如圖3展示的T細胞激活原理，ELISPOT方法學的靈敏度跟刺激物選擇有關，通常情況方法的靈敏度的高低排序為，含有多肽復合物的抗原遞呈細胞>多肽>蛋白/病毒顆粒。對于腫瘤疫苗和DC疫苗，由于機體免疫細胞對其反應比較溫和，建議使用最為靈敏的刺激物。熙寧生物有豐富的穩(wěn)轉細胞株和免疫細胞培養(yǎng)經驗，可進行有多肽復合物的抗原遞呈細胞的培養(yǎng)和制備，設計更加復雜也更加靈敏的ELISPOT檢測方法。
圖3. T細胞激活原理
2. 在臨床檢測過程中，從全血樣品采集到分離PBMC的中間時間不應超過8小時，不然分離出來的的PBMC的功能活性會受到極大影響，造成大部分樣品假陰性的結果。對于這個在臨床檢測分析的痛點，熙寧生物自主開發(fā)了相應的方法，可將全血分離PBMC的穩(wěn)定時間延長至48小時，在保證檢測結果真實可靠的前提下，滿足臨床運營商，從從臨床中心進行樣本采集運輸到分析實驗室的可操作性，考察結果如4所示：
圖4. 熙寧全血穩(wěn)定性測定結果
細胞免疫原性評估對象是PBMC，但PBMC由于全血采集后的穩(wěn)定性較差，且免疫背景較為復雜，使得ELISPOT的檢測結果的解析變得極為復雜，甚至很多時候檢測結果本身也有失真的風險。需要基于對方法和作用機理的充分理解，來保障檢測的順利進行。熙寧生物通過合理的樣品分組設計，方法學參數驗證確定，會對每一個臨床樣品的檢測數據進行充分解讀。同時基于臨床試驗樣品全血采集后穩(wěn)定性較短的難點，研發(fā)了一款全血穩(wěn)定劑，可將全血采集后的穩(wěn)定時間延長到48小時，在確保樣品穩(wěn)定結果真實的情況下盡可能了便利臨床運營。
基因治療作為熱門的新興療法，近些年發(fā)展迅速。同時，基因治療藥物研發(fā)需求多樣化、技術復雜度高的特點，也對檢測分析帶來巨大挑戰(zhàn)。熙寧生物搭建了基于基因治療藥物檢測需求的基因檢測平臺、細胞/病毒檢測平臺、流式檢測平臺和免疫檢測平臺等，能夠滿足研發(fā)項目在不同階段的在生物分析需求。團隊專注于GCT領域，積累了豐富的實戰(zhàn)經驗和專業(yè)的技術服務能力，通過qPCR/ddPCR技術、細胞法中和抗體檢測技術、ELISPOT細胞免疫原性檢測技術、流式檢測技術、ELISA/MSD檢測技術等多平臺技術互聯，打通技術隔閡，真正實現“一個臨床/項目，一個生物分析實驗室，一個技術項目團隊”的服務方式，為基因治療產品生物分析提供完整解決方案。
